Differentialdiagnos av lungknölar identifierade med datortomografi (CT) är fortfarande en utmaning i klinisk praxis.Här karakteriserar vi den globala metabolomen av 480 serumprover, inklusive friska kontroller, godartade lungknölar och stadium I lungadenokarcinom.Adenocarcinom uppvisar unika metabolomiska profiler, medan godartade knölar och friska individer har hög likhet i metabolomiska profiler.I upptäcktsgruppen (n = 306) identifierades en uppsättning av 27 metaboliter för att skilja mellan benigna och maligna knölar.AUC för diskriminantmodellen i grupperna för intern validering (n = 104) och extern validering (n = 111) var 0,915 respektive 0,945.Väganalys avslöjade ökade glykolytiska metaboliter associerade med minskat tryptofan i lungadenokarcinomserum jämfört med benigna knölar och friska kontroller, och föreslog att tryptofanupptag främjar glykolys i lungcancerceller.Vår studie belyser värdet av biomarkörer för serummetabolit för att bedöma risken för lungknölar som upptäcks med CT.
Tidig diagnos är avgörande för att förbättra överlevnaden för cancerpatienter.Resultat från US National Lung Cancer Screening Trial (NLST) och den europeiska NELSON-studien har visat att screening med lågdosdatortomografi (LDCT) avsevärt kan minska lungcancerdödligheten i högriskgrupper1,2,3.Sedan den utbredda användningen av LDCT för lungcancerscreening har incidensen av tillfälliga röntgenfynd av asymtomatiska lungknölar fortsatt att öka 4 .Lungknölar definieras som fokala opaciteter upp till 3 cm i diameter 5 .Vi står inför svårigheter med att bedöma sannolikheten för malignitet och att hantera det stora antalet lungknölar som tillfälligtvis upptäckts på LDCT.Begränsningar av CT kan leda till frekventa uppföljningsundersökningar och falskt positiva resultat, vilket leder till onödiga ingrepp och överbehandling6.Därför finns det ett behov av att utveckla pålitliga och användbara biomarkörer för att korrekt identifiera lungcancer i de tidiga stadierna och skilja de flesta godartade knölar vid initial upptäckt 7 .
Omfattande molekylär analys av blod (serum, plasma, perifera mononukleära blodceller), inklusive genomik, proteomik eller DNA-metylering8,9,10, har lett till ett växande intresse för upptäckten av diagnostiska biomarkörer för lungcancer.Samtidigt mäter metabolomics tillvägagångssätt cellulära slutprodukter som påverkas av endogena och exogena handlingar och används därför för att förutsäga sjukdomsuppkomst och resultat.Vätskekromatografi-tandem masspektrometri (LC-MS) är en flitigt använd metod för metabolomiska studier på grund av dess höga känslighet och stora dynamiska omfång, som kan täcka metaboliter med olika fysikalisk-kemiska egenskaper11,12,13.Även om global metabolomisk analys av plasma/serum har använts för att identifiera biomarkörer associerade med lungcancerdiagnos14,15,16,17 och behandlingseffektivitet, återstår 18 serummetabolitklassificerare för att skilja mellan benigna och maligna lungknölar att studera mycket.-massiv forskning.
Adenocarcinom och skivepitelcancer är de två huvudsakliga undertyperna av icke-småcellig lungcancer (NSCLC).Olika CT-screeningtest tyder på att adenokarcinom är den vanligaste histologiska typen av lungcancer1,19,20,21.I den här studien använde vi ultrapresterande vätskekromatografi-högupplösande masspektrometri (UPLC-HRMS) för att utföra metabolomikanalys på totalt 695 serumprover, inklusive friska kontroller, godartade lungknölar och CT-detekterade ≤3 cm.Screening för stadium I lungadenokarcinom.Vi identifierade en panel av serummetaboliter som skiljer lungadenokarcinom från benigna knölar och friska kontroller.Bananrikningsanalys visade att onormal tryptofan- och glukosmetabolism är vanliga förändringar i lungadenokarcinom jämfört med benigna knölar och friska kontroller.Slutligen etablerade och validerade vi en serummetabolisk klassificerare med hög specificitet och känslighet för att skilja mellan maligna och godartade lungknölar detekterade av LDCT, vilket kan hjälpa till med tidig differentialdiagnos och riskbedömning.
I den aktuella studien samlades köns- och åldersmatchade serumprover retrospektivt från 174 friska kontroller, 292 patienter med godartade lungknölar och 229 patienter med stadium I lungadenokarcinom.Demografiska egenskaper hos de 695 försökspersonerna visas i tilläggstabell 1.
Som visas i figur 1a, samlades totalt 480 serumprover, inklusive 174 friska kontroll (HC), 170 benigna knölar (BN) och 136 stadium I lungadenokarcinom (LA) prover, vid Sun Yat-sen University Cancer Center.Upptäcktskohort för oriktad metabolomisk profilering med hjälp av ultrapresterande vätskekromatografi-högupplöst masspektrometri (UPLC-HRMS).Som visas i tilläggsfigur 1 identifierades differentiella metaboliter mellan LA och HC, LA och BN för att upprätta en klassificeringsmodell och ytterligare utforska differentiell väganalys.104 prover som samlats in av Sun Yat-sen University Cancer Center och 111 prover som samlats in av två andra sjukhus utsattes för intern respektive extern validering.
en studiepopulation i upptäcktskohorten som genomgick global serummetabolomikanalys med hjälp av ultrapresterande vätskekromatografi-högupplöst masspektrometri (UPLC-HRMS).b Partiell minsta kvadraters diskriminantanalys (PLS-DA) av den totala metabolomen av 480 serumprover från studiekohorten, inklusive friska kontroller (HC, n = 174), benigna knölar (BN, n = 170) och stadium I lungadenokarcinom (Los Angeles, n = 136).+ESI, positivt elektrosprayjoniseringsläge, -ESI, negativt elektrosprayjoniseringsläge.c–e Metaboliter med signifikant olika förekomster i två givna grupper (två-tailed Wilcoxon signed rank test, falsk upptäcktshastighet justerat p-värde, FDR <0,05) visas i rött (faldig förändring > 1,2) och blått (faldig förändring < 0,83) .) visas på vulkangrafiken.f Hierarkisk klustringsvärmekarta som visar signifikanta skillnader i antalet annoterade metaboliter mellan LA och BN.Källdata tillhandahålls i form av källdatafiler.
Den totala serummetabolomen av 174 HC, 170 BN och 136 LA i upptäcktsgruppen analyserades med UPLC-HRMS-analys.Vi visar först att kvalitetskontrollprover (QC) kluster tätt i centrum av en oövervakad principal komponentanalys (PCA) modell, vilket bekräftar stabiliteten i den aktuella studiens prestanda (kompletterande figur 2).
Som visas i den partiella minsta kvadrat-diskriminerande analysen (PLS-DA) i figur 1b, fann vi att det fanns tydliga skillnader mellan LA och BN, LA och HC i positiva (+ESI) och negativa (−ESI) elektrosprayjoniseringslägen .isolerat.Emellertid hittades inga signifikanta skillnader mellan BN och HC i +ESI- och -ESI-förhållanden.
Vi hittade 382 differentiella egenskaper mellan LA och HC, 231 differentiella egenskaper mellan LA och BN, och 95 differentiella egenskaper mellan BN och HC (Wilcoxon signed rank test, FDR <0,05 och multipel förändring >1,2 eller <0,83) (Figur .1c-e) )..Toppar kommenterades ytterligare (kompletterande data 3) mot en databas (mzCloud/HMDB/Chemspider-bibliotek) genom m/z-värde, retentionstid och fragmenteringsmasspektrumsökning (detaljer beskrivs i avsnittet Metoder) 22 .Slutligen identifierades 33 och 38 kommenterade metaboliter med signifikanta skillnader i överflöd för LA kontra BN (Figur 1f och kompletterande tabell 2) och LA mot HC (kompletterande figur 3 och kompletterande tabell 2), respektive.Däremot identifierades endast 3 metaboliter med signifikanta skillnader i förekomst i BN och HC (kompletterande tabell 2), i överensstämmelse med överlappningen mellan BN och HC i PLS-DA.Dessa differentiella metaboliter täcker ett brett spektrum av biokemikalier (kompletterande figur 4).Sammantaget visar dessa resultat signifikanta förändringar i serummetabolomen som återspeglar malign transformation av lungcancer i tidigt stadium jämfört med godartade lungknölar eller friska försökspersoner.Samtidigt tyder likheten mellan serummetabolomen av BN och HC på att godartade lungknölar kan dela många biologiska egenskaper med friska individer.Med tanke på att genmutationer av epidermal tillväxtfaktorreceptor (EGFR) är vanliga i lungadenokarcinom subtyp 23, försökte vi bestämma effekten av förarmutationer på serummetabolomen.Vi analyserade sedan den övergripande metabolomiska profilen för 72 fall med EGFR-status i lungadenokarcinomgruppen.Intressant nog hittade vi jämförbara profiler mellan EGFR-mutantpatienter (n = 41) och EGFR-vildtypspatienter (n = 31) i PCA-analys (kompletterande figur 5a).Vi identifierade emellertid 7 metaboliter vars förekomst förändrades signifikant hos patienter med EGFR-mutation jämfört med patienter med vildtyps-EGFR (t-test, p < 0,05 och veckförändring > 1,2 eller < 0,83) (kompletterande figur 5b).Majoriteten av dessa metaboliter (5 av 7) är acylkarnitiner, som spelar en viktig roll i fettsyraoxidationsvägar.
Som illustreras i arbetsflödet som visas i figur 2a erhölls biomarkörer för nodulklassificering med användning av minst absoluta krympningsoperatorer och urval baserat på 33 differentiella metaboliter identifierade i LA (n = 136) och BN (n = 170).Bästa kombination av variabler (LASSO) – binär logistisk regressionsmodell.Tiofaldig korsvalidering användes för att testa modellens tillförlitlighet.Variabelurval och parameterreglering justeras med en sannolikhetsmaximeringsstraff med parameter λ24.Global metabolomics-analys utfördes vidare oberoende i grupperna för intern validering (n = 104) och extern validering (n = 111) för att testa klassificeringsprestanda för diskriminantmodellen.Som ett resultat identifierades 27 metaboliter i upptäcktsuppsättningen som den bästa diskriminantmodellen med det största genomsnittliga AUC-värdet (Fig. 2b), bland vilka 9 hade ökad aktivitet och 18 minskad aktivitet i LA jämfört med BN (Fig. 2c).
Arbetsflöde för att bygga en pulmonell nodulklassificerare, inklusive val av den bästa panelen av serummetaboliter i upptäcktsuppsättningen med hjälp av en binär logistisk regressionsmodell via tiofaldig korsvalidering och utvärdering av prediktiv prestanda i interna och externa valideringsuppsättningar.b Korsvalideringsstatistik för LASSO-regressionsmodell för urval av metabola biomarkörer.Siffrorna ovan representerar det genomsnittliga antalet biomarkörer valda vid en given λ.Den röda streckade linjen representerar det genomsnittliga AUC-värdet vid motsvarande lambda.Grå felstaplar representerar lägsta och högsta AUC-värden.Den prickade linjen indikerar den bästa modellen med de 27 utvalda biomarkörerna.AUC, area under mottagarens operationskarakteristik (ROC) kurva.c Vikförändringar av 27 utvalda metaboliter i LA-gruppen jämfört med BN-gruppen i upptäcktsgruppen.Röd kolumn – aktivering.Den blå kolumnen är en nedgång.d–f Receiver operating characteristic (ROC)-kurvor som visar kraften hos diskriminantmodellen baserad på 27 metabolitkombinationer i upptäckts-, interna och externa valideringsuppsättningar.Källdata tillhandahålls i form av källdatafiler.
En prediktionsmodell skapades baserat på de viktade regressionskoefficienterna för dessa 27 metaboliter (kompletterande tabell 3).ROC-analys baserad på dessa 27 metaboliter gav ett värde för area under kurvan (AUC) på 0,933, upptäcktsgruppskänsligheten var 0,868 och specificiteten var 0,859 (Fig. 2d).Under tiden, bland de 38 kommenterade differentiella metaboliterna mellan LA och HC, uppnådde en uppsättning av 16 metaboliter en AUC på 0,902 med en sensitivitet på 0,801 och specificitet på 0,856 för att skilja LA från HC (kompletterande figur 6a-c).AUC-värden baserade på olika tröskelvärden för dubbla förändringar för differentiella metaboliter jämfördes också.Vi fann att klassificeringsmodellen presterade bäst för att skilja mellan LA och BN (HC) när veckändringsnivån var inställd på 1,2 mot 1,5 eller 2,0 (kompletterande figur 7a,b).Klassificeringsmodellen, baserad på 27 metabolitgrupper, validerades ytterligare i interna och externa kohorter.AUC var 0,915 (sensitivitet 0,867, specificitet 0,811) för intern validering och 0,945 (sensitivitet 0,810, specificitet 0,979) för extern validering (Fig. 2e, f).För att bedöma interlaboratorieeffektiviteten analyserades 40 prover från den externa kohorten i ett externt laboratorium enligt beskrivningen i avsnittet Metoder.Klassificeringsnoggrannheten uppnådde en AUC på 0,925 (kompletterande figur 8).Eftersom lung skivepitelcancer (LUSC) är den näst vanligaste subtypen av icke-småcellig lungcancer (NSCLC) efter lungadenokarcinom (LUAD), testade vi också den validerade potentiella nyttan av metabola profiler.BN och 16 fall av LUSC.AUC för diskriminering mellan LUSC och BN var 0,776 (kompletterande figur 9), vilket indikerar sämre förmåga jämfört med diskriminering mellan LUAD och BN.
Studier har visat att storleken på knölar på CT-bilder är positivt korrelerad med sannolikheten för malignitet och förblir en viktig determinant för knölbehandling25,26,27.Analys av data från den stora kohorten av NELSON-screeningstudien visade att risken för malignitet hos patienter med noder <5 mm till och med liknade risken för patienter utan noder 28 .Därför är den minsta storleken som kräver regelbunden CT-övervakning 5 mm, som rekommenderats av British Thoracic Society (BTS), och 6 mm, som rekommenderas av Fleischner Society 29 .Knölar större än 6 mm och utan uppenbara godartade egenskaper, kallade indeterminate pulmonary nodules (IPN), förblir dock en stor utmaning vid utvärdering och hantering i klinisk praxis30,31.Vi undersökte sedan om nodulstorleken påverkade metabolomiska signaturer med hjälp av poolade prover från upptäckten och interna valideringskohorter.Med fokus på 27 validerade biomarkörer jämförde vi först PCA-profilerna för HC och BN sub-6 mm metabolomer.Vi fann att de flesta av datapunkterna för HC och BN överlappade, vilket visar att serummetabolitnivåerna var likartade i båda grupperna (Fig. 3a).Funktionskartorna över olika storleksområden förblev bevarade i BN och LA (Fig. 3b, c), medan en separation observerades mellan maligna och godartade knölar i intervallet 6–20 mm (Fig. 3d).Denna kohort hade en AUC på 0,927, specificitet på 0,868 och sensitivitet på 0,820 för att förutsäga maligniteten hos knölar som mätte 6 till 20 mm (fig. 3e, f).Våra resultat visar att klassificeraren kan fånga metaboliska förändringar orsakade av tidig malign transformation, oavsett nodulstorlek.
ad Jämförelse av PCA-profiler mellan specificerade grupper baserat på en metabolisk klassificering av 27 metaboliter.CC och BN < 6 mm.b BN < 6 mm vs BN 6–20 mm.i LA 6–20 mm kontra LA 20–30 mm.g BN 6–20 mm och LA 6–20 mm.GC, n = 174;BN < 6 mm, n = 153;BN 6–20 mm, n = 91;LA 6–20 mm, n = 89;LA 20–30 mm, n = 77. e Receiver operating characteristic (ROC) kurva som visar diskriminerande modellprestanda för noduler 6–20 mm.f Sannolikhetsvärden beräknades utifrån den logistiska regressionsmodellen för knölar som mäter 6–20 mm.Den grå streckade linjen representerar det optimala gränsvärdet (0,455).Siffrorna ovan representerar procentandelen av fall som beräknas för Los Angeles.Använd ett tvåsidigt Students t-test.PCA, huvudkomponentanalys.AUC-area under kurvan.Källdata tillhandahålls i form av källdatafiler.
Fyra prover (i åldern 44–61 år) med liknande lungknölstorlekar (7–9 mm) valdes ytterligare ut för att illustrera prestandan hos den föreslagna malignitetsprediktionsmodellen (Fig. 4a, b).Vid initial screening visade fall 1 sig som en solid knöl med förkalkning, en egenskap som är förknippad med benignitet, medan fall 2 presenterades som en obestämd delvis solid knöl utan uppenbara godartade egenskaper.Tre omgångar av uppföljande CT-skanningar visade att dessa fall förblev stabila under en 4-årsperiod och ansågs därför vara godartade knölar (Fig. 4a).Jämfört med klinisk utvärdering av seriella CT-skanningar, identifierade single-shot serummetabolitanalys med den nuvarande klassificeringsmodellen snabbt och korrekt dessa godartade knölar baserat på probabilistiska begränsningar (tabell 1).Figur 4b i fall 3 visar en knöl med tecken på pleural retraktion, vilket oftast är förknippat med malignitet32.Fall 4 presenteras som en obestämd delvis solid knöl utan bevis för en godartad orsak.Alla dessa fall förutspåddes som maligna enligt klassificeringsmodellen (tabell 1).Bedömningen av lungadenokarcinom visades genom histopatologisk undersökning efter lungresektionskirurgi (Fig. 4b).För den externa valideringsuppsättningen förutspådde den metaboliska klassificeraren exakt två fall av obestämda lungknölar större än 6 mm (kompletterande figur 10).
CT-bilder av det axiella fönstret i lungorna i två fall av godartade knölar.I fall 1 visade CT-skanning efter 4 år en stabil solid nodul som mätte 7 mm med förkalkning i höger nedre lob.I fall 2 visade CT-skanning efter 5 år en stabil, delvis solid knöl med en diameter på 7 mm i den högra övre loben.b Axiella fönster CT-bilder av lungorna och motsvarande patologiska studier av två fall av stadium I adenokarcinom före lungresektion.Fall 3 avslöjade en knöl med en diameter på 8 mm i den högra övre loben med pleural retraktion.Fall 4 avslöjade en delvis solid slipad glasknöl som mätte 9 mm i den vänstra övre loben.Hematoxylin- och eosin- (H&E)-färgning av resekerad lungvävnad (skalastapel = 50 μm) som visar det acinära tillväxtmönstret för lungadenokarcinom.Pilar indikerar knölar som upptäckts på CT-bilder.H&E-bilder är representativa bilder av flera (>3) mikroskopiska fält som undersökts av patologen.
Sammantaget visar våra resultat det potentiella värdet av biomarkörer för serummetabolit i differentialdiagnosen av lungknölar, vilket kan utgöra utmaningar vid utvärdering av CT-screening.
Baserat på en validerad differentiell metabolitpanel, försökte vi identifiera biologiska korrelat av stora metabola förändringar.KEGG-väganrikningsanalys av MetaboAnalyst identifierade 6 vanliga signifikant förändrade vägar mellan de två givna grupperna (LA vs. HC och LA vs. BN, justerad p ≤ 0,001, effekt > 0,01).Dessa förändringar karakteriserades av störningar i pyruvatmetabolism, tryptofanmetabolism, niacin- och nikotinamidmetabolism, glykolys, TCA-cykeln och purinmetabolism (Fig. 5a).Vi utförde sedan ytterligare riktad metabolomik för att verifiera stora förändringar med hjälp av absolut kvantifiering.Bestämning av vanliga metaboliter i vanligt förändrade vägar genom trippelkvadrupolmasspektrometri (QQQ) med autentiska metabolitstandarder.Demografiska egenskaper för metabolomikstudiens målprov ingår i tilläggstabell 4. I enlighet med våra globala metabolomics-resultat bekräftade kvantitativ analys att hypoxantin och xantin, pyruvat och laktat ökade i LA jämfört med BN och HC (Fig. 5b, c, p <0,05).Inga signifikanta skillnader i dessa metaboliter hittades dock mellan BN och HC.
KEGG-väganrikningsanalys av signifikant olika metaboliter i LA-gruppen jämfört med BN- och HC-grupperna.Ett tvåsidigt Globaltest användes och p-värden justerades med Holm-Bonferroni-metoden (justerad p ≤ 0,001 och effektstorlek > 0,01).b–d Violindiagram som visar nivåer av hypoxantin, xantin, laktat, pyruvat och tryptofan i serum HC, BN och LA bestämt med LC-MS/MS (n = 70 per grupp).Vita och svarta streckade linjer indikerar median respektive kvartil.e Violinplot som visar normaliserat Log2TPM (transkript per miljon) mRNA-uttryck av SLC7A5 och QPRT i lungadenokarcinom (n = 513) jämfört med normal lungvävnad (n = 59) i LUAD-TCGA-datauppsättningen.Den vita rutan representerar interkvartilområdet, den horisontella svarta linjen i mitten representerar medianen och den vertikala svarta linjen som sträcker sig från rutan representerar 95 % konfidensintervall (CI).f Pearson-korrelationsplot av SLC7A5 och GAPDH-uttryck i lungadenokarcinom (n = 513) och normal lungvävnad (n = 59) i TCGA-datauppsättningen.Det grå området representerar 95 % KI.r, Pearson korrelationskoefficient.g Normaliserade cellulära tryptofannivåer i A549-celler transfekterade med ospecifik shRNA-kontroll (NC) och shSLC7A5 (Sh1, Sh2) bestämd med LC-MS/MS.Statistisk analys av fem biologiskt oberoende prover i varje grupp presenteras.h Cellulära nivåer av NADt (total NAD, inklusive NAD+ och NADH) i A549-celler (NC) och SLC7A5 knockdown A549-celler (Sh1, Sh2).Statistisk analys av tre biologiskt oberoende prover i varje grupp presenteras.i Glykolytisk aktivitet av A549-celler före och efter SLC7A5-nedbrytning mättes med extracellulär surhetsgrad (ECAR) (n = 4 biologiskt oberoende prover per grupp).2-DG,2-deoxi-D-glukos.Tvåsidigt Students t-test användes i (b–h).I (g–i) representerar felstaplar medelvärdet ± SD, varje experiment utfördes tre gånger oberoende och resultaten var liknande.Källdata tillhandahålls i form av källdatafiler.
Med tanke på den betydande effekten av förändrad tryptofanmetabolism i LA-gruppen, bedömde vi också serumtryptofannivåer i HC-, BN- och LA-grupperna med QQQ.Vi fann att serumtryptofan minskade i LA jämfört med HC eller BN (p < 0,001, figur 5d), vilket överensstämmer med tidigare fynd att cirkulerande tryptofannivåer är lägre hos patienter med lungcancer än hos friska kontroller från kontrollgruppen33,34 ,35.En annan studie med PET/CT-spårämne 11C-metyl-L-tryptofan fann att retentionstiden för tryptofansignalen i lungcancervävnad ökade signifikant jämfört med benigna lesioner eller normal vävnad36.Vi antar att minskningen av tryptofan i LA-serum kan återspegla aktivt tryptofanupptag av lungcancerceller.
Det är också känt att slutprodukten av kynureninvägen för tryptofankatabolism är NAD+37,38, vilket är ett viktigt substrat för reaktionen av glyceraldehyd-3-fosfat med 1,3-bisfosfoglycerat i glykolys39.Medan tidigare studier har fokuserat på rollen av tryptofan katabolism i immunreglering, försökte vi belysa samspelet mellan tryptofan dysregulation och glykolytiska vägar observerade i den aktuella studien.Solute-transportör familj 7 medlem 5 (SLC7A5) är känd för att vara en tryptofan-transportör43,44,45.Kinolinsyrafosforibosyltransferas (QPRT) är ett enzym beläget nedströms kynureninvägen som omvandlar kinolinsyra till NAMN46.Inspektion av LUAD TCGA-datauppsättningen visade att både SLC7A5 och QPRT var signifikant uppreglerade i tumörvävnad jämfört med normal vävnad (Fig. 5e).Denna ökning observerades i stadier I och II såväl som stadier III och IV av lungadenokarcinom (kompletterande figur 11), vilket indikerar tidiga störningar i tryptofanmetabolism associerad med tumörbildning.
Dessutom visade LUAD-TCGA-datauppsättningen en positiv korrelation mellan SLC7A5 och GAPDH mRNA-uttryck i cancerpatientprover (r = 0,45, p = 1,55E-26, figur 5f).Däremot hittades ingen signifikant korrelation mellan sådana gensignaturer i normal lungvävnad (r = 0,25, p = 0,06, figur 5f).Nedbrytning av SLC7A5 (kompletterande figur 12) i A549-celler reducerade signifikant cellulär tryptofan- och NAD(H)-nivåer (figur 5g, h), vilket resulterade i försvagad glykolytisk aktivitet mätt med extracellulär surhetsgrad (ECAR) (figur 1).5i).Baserat på metabola förändringar i serum och in vitro-detektion, antar vi att tryptofanmetabolism kan producera NAD+ genom kynureninvägen och spela en viktig roll för att främja glykolys vid lungcancer.
Studier har visat att ett stort antal obestämda lungknölar som detekteras av LDCT kan leda till behov av ytterligare tester såsom PET-CT, lungbiopsi och överbehandling på grund av en falsk positiv diagnos av malignitet.31 Som visas i figur 6, vår studie identifierade en panel av serummetaboliter med potentiellt diagnostiskt värde som kan förbättra riskstratifieringen och efterföljande hantering av lungknölar detekterade med CT.
Lungknölar utvärderas med hjälp av lågdosdatortomografi (LDCT) med avbildningsegenskaper som tyder på godartade eller maligna orsaker.Det osäkra utfallet av knölar kan leda till täta uppföljningsbesök, onödiga ingrepp och överbehandling.Inkluderandet av serummetaboliska klassificerare med diagnostiskt värde kan förbättra riskbedömningen och efterföljande hantering av lungknölar.PET-positronemissionstomografi.
Data från den amerikanska NLST-studien och den europeiska NELSON-studien tyder på att screening av högriskgrupper med lågdosdatortomografi (LDCT) kan minska dödligheten i lungcancer1,3.Riskbedömning och efterföljande klinisk hantering av ett stort antal tillfälliga lungknölar som upptäckts av LDCT är dock fortfarande de mest utmanande.Huvudmålet är att optimera den korrekta klassificeringen av befintliga LDCT-baserade protokoll genom att införliva pålitliga biomarkörer.
Vissa molekylära biomarkörer, såsom blodmetaboliter, har identifierats genom att jämföra lungcancer med friska kontroller15,17.I den aktuella studien fokuserade vi på tillämpningen av serummetabolomikanalys för att skilja mellan godartade och maligna lungknölar som av misstag upptäckts av LDCT.Vi jämförde den globala serummetabolomen för frisk kontroll (HC), godartade lungknölar (BN) och prover av stadium I lungadenokarcinom (LA) med UPLC-HRMS-analys.Vi fann att HC och BN hade liknande metaboliska profiler, medan LA visade signifikanta förändringar jämfört med HC och BN.Vi identifierade två uppsättningar av serummetaboliter som skiljer LA från HC och BN.
Det nuvarande LDCT-baserade identifieringsschemat för benigna och maligna knölar är huvudsakligen baserat på storleken, densiteten, morfologin och tillväxthastigheten av knölar över tid30.Tidigare studier har visat att storleken på knölar är nära relaterad till sannolikheten för lungcancer.Även hos högriskpatienter är risken för malignitet i noder <6 mm <1%.Risken för malignitet för knölar som mäter 6 till 20 mm varierar från 8 % till 64 %30.Därför rekommenderar Fleischner Society en cutoff-diameter på 6 mm för rutinmässig CT-uppföljning.29 Riskbedömning och hantering av obestämda lungknölar (IPN) större än 6 mm har dock inte utförts adekvat 31 .Nuvarande hantering av medfödd hjärtsjukdom är vanligtvis baserad på vaksam väntan med frekvent CT-övervakning.
Baserat på den validerade metabolomen visade vi för första gången överlappningen av metabolomiska signaturer mellan friska individer och benigna knölar <6 mm.Den biologiska likheten överensstämmer med tidigare CT-fynd att risken för malignitet för knölar <6 mm är lika låg som för försökspersoner utan knutar.30 Det bör noteras att våra resultat också visar att benigna knölar <6 mm och ≥6 mm har höga likhet i metabolomiska profiler, vilket tyder på att den funktionella definitionen av benign etiologi är konsekvent oavsett nodulstorlek.Således kan moderna diagnostiska serummetabolitpaneler tillhandahålla en enda analys som ett uteslutande test när knölar initialt detekteras på CT och potentiellt minska seriell övervakning.Samtidigt skiljde samma panel av metaboliska biomarkörer maligna knölar ≥6 mm i storlek från godartade knölar och gav exakta förutsägelser för IPN av liknande storlek och tvetydiga morfologiska egenskaper på CT-bilder.Denna serummetabolismklassificerare presterade bra i att förutsäga maligniteten hos knölar ≥6 mm med en AUC på 0,927.Sammantaget indikerar våra resultat att unika metabolomiska signaturer i serum specifikt kan spegla tidiga tumörinducerade metabola förändringar och ha potentiellt värde som riskprediktorer, oberoende av nodulstorlek.
Noterbart är lungadenokarcinom (LUAD) och skivepitelcancer (LUSC) huvudtyperna av icke-småcellig lungcancer (NSCLC).Med tanke på att LUSC är starkt förknippat med tobaksanvändning47 och LUAD är den vanligaste histologin av tillfälliga lungknölar som upptäckts vid CT-screening48, byggdes vår klassificeringsmodell specifikt för steg I-adenokarcinomprover.Wang och kollegor fokuserade också på LUAD och identifierade nio lipidsignaturer med hjälp av lipidomik för att skilja lungcancer i tidigt stadium från friska individer17.Vi testade den nuvarande klassificeringsmodellen på 16 fall av stadium I LUSC och 74 benigna knölar och observerade låg LUSC-prediktionsnoggrannhet (AUC 0,776), vilket tyder på att LUAD och LUSC kan ha sina egna metabolomiska signaturer.LUAD och LUSC har faktiskt visat sig skilja sig åt i etiologi, biologiskt ursprung och genetiska avvikelser49.Därför bör andra typer av histologi inkluderas i träningsmodeller för populationsbaserad detektion av lungcancer i screeningprogram.
Här identifierade vi de sex vanligast förändrade vägarna i lungadenokarcinom jämfört med friska kontroller och godartade knölar.Xantin och hypoxantin är vanliga metaboliter i purinens metaboliska väg.I enlighet med våra resultat ökade intermediärer associerade med purinmetabolism signifikant i serum eller vävnader hos patienter med lungadenokarcinom jämfört med friska kontroller eller patienter i preinvasivt stadium15,50.Förhöjda nivåer av xantin och hypoxantin i serum kan återspegla den anabolism som krävs av snabbt prolifererande cancerceller.Dysregulation av glukosmetabolism är ett välkänt kännetecken för cancermetabolism51.Här observerade vi en signifikant ökning av pyruvat och laktat i LA-gruppen jämfört med HC- och BN-gruppen, vilket överensstämmer med tidigare rapporter om glykolytiska vägavvikelser i serummetabolomprofilerna hos patienter med icke-småcellig lungcancer (NSCLC) och friska kontroller.resultaten är konsekventa52,53.
Viktigt är att vi observerade en omvänd korrelation mellan pyruvat- och tryptofanmetabolism i serum från lungadenokarcinom.Serumtryptofannivåerna reducerades i LA-gruppen jämfört med HC- eller BN-gruppen.Intressant nog fann en tidigare storskalig studie med en prospektiv kohort att låga nivåer av cirkulerande tryptofan var associerade med en ökad risk för lungcancer 54 .Tryptofan är en essentiell aminosyra som vi får helt och hållet från maten.Vi drar slutsatsen att utarmning av tryptofan i serum i lungadenokarcinom kan återspegla snabb utarmning av denna metabolit.Det är välkänt att slutprodukten av tryptofankatabolism via kynureninvägen är källan till de novo NAD+-syntesen.Eftersom NAD+ huvudsakligen produceras genom räddningsvägen, återstår betydelsen av NAD+ i tryptofanmetabolismen för hälsa och sjukdom att fastställas46.Vår analys av TCGA-databasen visade att uttrycket av tryptofantransportören löst transportör 7A5 (SLC7A5) ökade signifikant i lungadenokarcinom jämfört med normala kontroller och var positivt korrelerad med uttrycket av det glykolytiska enzymet GAPDH.Tidigare studier har främst fokuserat på tryptofankatabolismens roll för att undertrycka antitumörimmunsvaret40,41,42.Här visar vi att hämning av tryptofanupptag genom knockdown av SLC7A5 i lungcancerceller resulterar i en efterföljande minskning av cellulära NAD-nivåer och en åtföljande försvagning av glykolytisk aktivitet.Sammanfattningsvis ger vår studie en biologisk grund för förändringar i serummetabolism i samband med malign transformation av lungadenokarcinom.
EGFR-mutationer är de vanligaste drivarmutationerna hos patienter med NSCLC.I vår studie fann vi att patienter med EGFR-mutation (n = 41) hade övergripande metabolomiska profiler som liknar patienter med vildtyps-EGFR (n = 31), även om vi fann minskade serumnivåer hos vissa EGFR-muterade patienter hos acylkarnitinpatienter.Acylkarnitinernas etablerade funktion är att transportera acylgrupper från cytoplasman in i mitokondriella matrisen, vilket leder till oxidation av fettsyror för att producera energi 55 .I enlighet med våra resultat identifierade en nyligen genomförd studie också liknande metabolomprofiler mellan EGFR-mutant- och EGFR-vildtypstumörer genom att analysera den globala metabolomen av 102 lungadenokarcinomvävnadsprover50.Intressant nog hittades acylkarnitininnehåll också i EGFR-mutantgruppen.Om förändringar i acylkarnitinnivåer återspeglar EGFR-inducerade metabola förändringar och de underliggande molekylära vägarna kan därför förtjäna ytterligare studier.
Sammanfattningsvis etablerar vår studie en metabolisk klassificerare i serum för differentialdiagnos av lungknölar och föreslår ett arbetsflöde som kan optimera riskbedömning och underlätta klinisk hantering baserat på CT-scanning.
Denna studie godkändes av den etiska kommittén vid Sun Yat-sen University Cancer Hospital, det första anslutna sjukhuset vid Sun Yat-sen University och den etiska kommittén vid Zhengzhou University Cancer Hospital.I grupperna för upptäckt och interna validering samlades 174 sera från friska individer och 244 sera från godartade knölar från individer som genomgick årliga medicinska undersökningar vid avdelningen för cancerkontroll och förebyggande, Sun Yat-sen University Cancer Center och 166 godartade knölar.serum.Steg I lungadenokarcinom samlades in från Sun Yat-sen University Cancer Center.I den externa valideringskohorten fanns det 48 fall av godartade knölar, 39 fall av stadium I lungadenokarcinom från First Affiliated Hospital vid Sun Yat-sen University och 24 fall av stadium I lungadenokarcinom från Zhengzhou Cancer Hospital.Sun Yat-sen University Cancer Center samlade också in 16 fall av skivepitelcellscancer i stadium I för att testa den diagnostiska förmågan hos den etablerade metaboliska klassificeraren (patientens egenskaper visas i tilläggstabell 5).Prover från upptäcktskohorten och intern valideringskohort samlades in mellan januari 2018 och maj 2020. Prover för den externa valideringskohorten samlades in mellan augusti 2021 och oktober 2022. För att minimera könsbias tilldelades ungefär lika många manliga och kvinnliga fall till varje kohort.Discovery Team och Intern Review Team.Deltagarens kön fastställdes baserat på självrapportering.Informerat samtycke erhölls från alla deltagare och ingen ersättning lämnades.Försökspersoner med godartade knölar var de med en stabil datortomografi efter 2 till 5 år vid analystillfället, förutom 1 fall från det externa valideringsprovet, som samlades in preoperativt och diagnostiserades med histopatologi.Med undantag för kronisk bronkit.Lungadenokarcinomfall samlades in före lungresektion och bekräftades genom patologisk diagnos.Fastande blodprover samlades i serumseparationsrör utan några antikoagulantia.Blodprover koagulerades under 1 timme vid rumstemperatur och centrifugerades sedan vid 2851 x g under 10 minuter vid 4°C för att samla upp serumsupernatant.Serumalikvoter frystes vid -80°C tills metabolitextraktion.Institutionen för cancerprevention och medicinsk undersökning vid Sun Yat-sen University Cancer Center samlade in en pool av serum från 100 friska donatorer, inklusive lika många män och kvinnor i åldern 40 till 55 år.Lika volymer av varje donatorprov blandades, den resulterande poolen delades upp i alikvoter och förvarades vid -80°C.Serumblandningen användes som referensmaterial för kvalitetskontroll och datastandardisering.
Referensserum och testprover tinades och metaboliter extraherades med en kombinerad extraktionsmetod (MTBE/metanol/vatten) 56 .Kortfattat blandades 50 μl serum med 225 μl iskall metanol och 750 μl iskall metyl-tert-butyleter (MTBE).Rör om blandningen och inkubera på is i 1 timme.Proverna blandades sedan och vortexblandades med 188 μl vatten av MS-kvalitet innehållande interna standarder (13C-laktat, 13C3-pyruvat, 13C-metionin och 13C6-isoleucin, köpt från Cambridge Isotope Laboratories).Blandningen centrifugerades sedan vid 15 000 × g i 10 minuter vid 4 ° C, och den nedre fasen överfördes till två rör (125 μL vardera) för LC-MS-analys i positiva och negativa lägen.Slutligen indunstades provet till torrhet i en höghastighetsvakuumkoncentrator.
De torkade metaboliterna rekonstituerades i 120 μl 80 % acetonitril, virvlades i 5 minuter och centrifugerades vid 15 000 × g i 10 minuter vid 4°C.Supernatanter överfördes till bärnstensfärgade glasflaskor med mikroinsatser för metabolomiska studier.Oriktad metabolomikanalys på en ultrapresterande vätskekromatografi-högupplöst masspektrometri (UPLC-HRMS) plattform.Metaboliter separerades med hjälp av ett Dionex Ultimate 3000 UPLC-system och en ACQUITY BEH Amide-kolonn (2,1 × 100 mm, 1,7 μm, Waters).I positiv jonläge var de mobila faserna 95 % (A) och 50 % acetonitril (B), var och en innehållande 10 mmol/L ammoniumacetat och 0,1 % myrsyra.I negativt läge innehöll mobila faser A och B 95 % respektive 50 % acetonitril, båda faserna innehöll 10 mmol/L ammoniumacetat, pH = 9. Gradientprogrammet var följande: 0–0,5 min, 2 % B;0,5–12 min, 2–50 % B;12–14 min, 50–98 % B;14–16 min, 98 % B;16–16.1.min, 98-2% B;16,1–20 min, 2 % B. Kolonnen hölls vid 40°C och provet vid 10°C i autosamplern.Flödeshastigheten var 0,3 ml/min, injektionsvolymen var 3 μl.En Q-Exactive Orbitrap-masspektrometer (Thermo Fisher Scientific) med en elektrosprayjoniseringskälla (ESI) kördes i fullskanningsläge och kopplades till ddMS2-övervakningsläget för att samla in stora mängder data.MS-parametrarna ställdes in enligt följande: sprayspänning +3,8 kV/- 3,2 kV, kapillärtemperatur 320°C, skyddsgas 40 arb, hjälpgas 10 arb, sondvärmartemperatur 350°C, skanningsområde 70–1050 m/h, upplösning.70 000. Data insamlades med Xcalibur 4.1 (Thermo Fisher Scientific).
För att bedöma datakvaliteten genererades poolade kvalitetskontrollprover (QC) genom att ta bort 10 μL alikvoter av supernatanten från varje prov.Sex kvalitetskontrollprovinjektioner analyserades i början av den analytiska sekvensen för att bedöma stabiliteten hos UPLC-MS-systemet.Kvalitetskontrollprover införs sedan periodiskt i partiet.Alla 11 satser av serumprover i denna studie analyserades med LC-MS.Alikvoter av en serumpoolblandning från 100 friska donatorer användes som referensmaterial i respektive batcher för att övervaka extraktionsprocessen och justera för batch-till-batch-effekter.Oriktad metabolomisk analys av upptäcktskohorten, intern valideringskohort och extern valideringskohort utfördes vid Metabolomics Center vid Sun Yat-sen University.Det externa laboratoriet vid Guangdong University of Technology Analysis and Testing Center analyserade också 40 prover från den externa kohorten för att testa klassificeringsmodellens prestanda.
Efter extraktion och rekonstitution mättes den absoluta kvantifieringen av serummetaboliter med hjälp av ultrahögpresterande vätskekromatografi-tandem masspektrometri (Agilent 6495 triple quadrupole) med en elektrosprayjoniseringskälla (ESI) i multipel reaktionsövervakning (MRM).En ACQUITY BEH Amide-kolonn (2,1 × 100 mm, 1,7 μm, Waters) användes för att separera metaboliter.Den mobila fasen bestod av 90 % (A) och 5 % acetonitril (B) med 10 mmol/L ammoniumacetat och 0,1 % ammoniaklösning.Gradientprogrammet var som följer: 0–1,5 min, 0 % B;1,5–6,5 min, 0–15 % B;6,5–8 min, 15 % B;8–8,5 min, 15 %–0 % B;8,5–11,5 min, 0 %B.Kolonnen hölls vid 40°C och provet vid 10°C i autosamplern.Flödeshastigheten var 0,3 mL/min och injektionsvolymen var 1 μL.MS-parametrar ställdes in enligt följande: kapillärspänning ±3,5 kV, nebulisatortryck 35 psi, mantelgasflöde 12 l/min, mantelgastemperatur 350°C, torkgastemperatur 250°C och torkgasflöde 14 l/min.MRM-omvandlingarna av tryptofan, pyruvat, laktat, hypoxantin och xantin var 205,0–187,9, 87,0–43,4, 89,0–43,3, 135,0–92,3 och 151,0–107.9 respektive.Data samlades in med användning av Mass Hunter B.07.00 (Agilent Technologies).För serumprover kvantifierades tryptofan, pyruvat, laktat, hypoxantin och xantin med användning av kalibreringskurvor för standardblandningslösningar.För cellprover normaliserades tryptofanhalten till den interna standarden och cellproteinmassan.
Toppextraktion (m/z och retentionstid (RT)) utfördes med användning av Compound Discovery 3.1 och TraceFinder 4.0 (Thermo Fisher Scientific).För att eliminera potentiella skillnader mellan satser, delades varje karakteristisk topp i testprovet med den karakteristiska toppen för referensmaterialet från samma sats för att erhålla den relativa mängden.De relativa standardavvikelserna för interna standarder före och efter standardisering visas i tilläggstabell 6. Skillnader mellan de två grupperna kännetecknades av falsk upptäcktsfrekvens (FDR<0,05, Wilcoxon signed rank test) och veckförändring (>1,2 eller <0,83).Rå MS-data för de extraherade funktionerna och referensserumkorrigerade MS-data visas i kompletterande data 1 respektive kompletterande data 2.Toppannotering utfördes baserat på fyra definierade nivåer av identifiering, inklusive identifierade metaboliter, förmodat kommenterade föreningar, förmodat karakteriserade föreningsklasser och okända föreningar 22 .Baserat på databassökningar i Compound Discovery 3.1 (mzCloud, HMDB, Chemspider), valdes slutligen biologiska föreningar med MS/MS-matchande validerade standarder eller exakt matchningsannoteringar i mzCloud (poäng > 85) eller Chemspider som mellanprodukter mellan differentialmetabolomen.Toppkommentarer för varje funktion ingår i kompletterande data 3. MetaboAnalyst 5.0 användes för univariat analys av summa-normaliserad metabolitförekomst.MetaboAnalyst 5.0 utvärderade också KEGG-väganrikningsanalys baserad på signifikant olika metaboliter.Principal component analysis (PCA) och partiell minsta kvadraters diskriminantanalys (PLS-DA) analyserades med hjälp av ropls mjukvarupaket (v.1.26.4) med stacknormalisering och autoskalning.Den optimala biomarkörmodellen för metabolit för att förutsäga nodulmalignitet genererades med hjälp av binär logistisk regression med minsta absoluta krympnings- och urvalsoperatör (LASSO, R-paket v.4.1-3).Prestanda för diskriminantmodellen i detektions- och valideringsuppsättningarna karakteriserades av att uppskatta AUC baserat på ROC-analys enligt pROC-paketet (v.1.18.0.).Den optimala sannolikhetsgränsen erhölls baserat på modellens maximala Youden-index (sensitivitet + specificitet – 1).Prover med värden lägre eller högre än tröskeln kommer att förutsägas som benigna knölar respektive lungadenokarcinom.
A549-celler (#CCL-185, American Type Culture Collection) odlades i F-12K-medium innehållande 10 % FBS.Korta hårnåls-RNA (shRNA)-sekvenser riktade mot SLC7A5 och en icke-målstyrd kontroll (NC) infogades i den lentivirala vektorn pLKO.1-puro.Antisenssekvenserna för shSLC7A5 är som följer: Sh1 (5'-GGAGAAACCTGATGAACAGTT-3'), Sh2 (5'-GCCGTGGACTTCGGGAACTAT-3').Antikroppar mot SLC7A5 (#5347) och tubulin (#2148) köptes från Cell Signaling Technology.Antikroppar mot SLC7A5 och tubulin användes i en spädning av 1:1000 för Western blot-analys.
Seahorse XF Glycolytic Stress Test mäter extracellulära försurningsnivåer (ECAR).I analysen administrerades glukos, oligomycin A och 2-DG sekventiellt för att testa cellulär glykolytisk kapacitet mätt med ECAR.
A549-celler transfekterade med icke-målkontroll (NC) och shSLC7A5 (Sh1, Sh2) ströks över natten i 10 cm diameter skålar.Cellmetaboliter extraherades med 1 ml iskall 80% vattenhaltig metanol.Celler i metanollösningen skrapades av, samlades upp i ett nytt rör och centrifugerades vid 15 000 x g under 15 minuter vid 4°C.Samla upp 800 µl supernatant och torka med en höghastighetsvakuumkoncentrator.De torkade metabolitpelletarna analyserades sedan med avseende på tryptofannivåer med användning av LC-MS/MS såsom beskrivits ovan.Cellulära NAD(H)-nivåer i A549-celler (NC och shSLC7A5) mättes med användning av ett kvantitativt NAD+/NADH kolorimetriskt kit (#K337, BioVision) enligt tillverkarens instruktioner.Proteinnivåer mättes för varje prov för att normalisera mängden metaboliter.
Inga statistiska metoder användes för att preliminärt bestämma provstorleken.Tidigare metabolomikstudier som syftar till upptäckt av biomarkörer15,18 har betraktats som riktmärken för storleksbestämning, och jämfört med dessa rapporter var vårt urval adekvat.Inga prover exkluderades från studiekohorten.Serumprover fördelades slumpmässigt till en upptäcktsgrupp (306 fall, 74,6 %) och en intern valideringsgrupp (104 fall, 25,4 %) för oriktade metabolomiska studier.Vi valde också slumpmässigt ut 70 fall från varje grupp från upptäcktsuppsättningen för riktade metabolomiska studier.Utredarna var blinda för grupptilldelning under LC-MS datainsamling och analys.Statistiska analyser av metabolomikdata och cellexperiment beskrivs i respektive sektioner för resultat, figurförklaringar och metoder.Kvantifiering av cellulär tryptofan, NADT och glykolytisk aktivitet utfördes tre gånger oberoende med identiska resultat.
För mer information om studiens design, se Natural Portfolio Report Abstract som är kopplat till den här artikeln.
Rå MS-data för de extraherade egenskaperna och normaliserade MS-data för referensserumet visas i kompletterande data 1 respektive kompletterande data 2.Toppkommentarer för differentiella funktioner presenteras i kompletterande data 3. LUAD TCGA-datauppsättningen kan laddas ner från https://portal.gdc.cancer.gov/.Indata för att plotta grafen finns i källdata.Källdata tillhandahålls för den här artikeln.
National Lung Screening Study Group, etc. Minska lungcancerdödligheten med lågdosdatortomografi.Norra England.J. Med.365, 395–409 (2011).
Kramer, BS, Berg, KD, Aberle, DR och Prophet, PC Lungcancerscreening med lågdos spiralformad CT: resultat från National Lung Screening Study (NLST).J. Med.Skärm 18, 109–111 (2011).
De Koning, HJ, et al.Minskad lungcancerdödlighet med volymetrisk CT-screening i en randomiserad studie.Norra England.J. Med.382, 503–513 (2020).
Posttid: 2023-09-18