Differentialdiagnos av lungnoduler identifierade med datortomografi (CT) är fortfarande en utmaning i klinisk praxis. Här karakteriserar vi den globala metabolomen hos 480 serumprover, inklusive friska kontroller, godartade lungnoduler och lungadenokarcinom i stadium I. Adenocarcinom uppvisar unika metabolomiska profiler, medan godartade noduler och friska individer har hög likhet i metabolomiska profiler. I upptäcktsgruppen (n = 306) identifierades en uppsättning av 27 metaboliter för att differentiera mellan godartade och maligna noduler. AUC för diskriminantmodellen i grupperna med intern validering (n = 104) respektive extern validering (n = 111) var 0,915 respektive 0,945. Analys av metabola signalvägar visade ökade glykolytiska metaboliter associerade med minskat tryptofan i lungadenokarcinomserum jämfört med godartade noduler och friska kontroller, och antydde att tryptofanupptag främjar glykolys i lungcancerceller. Vår studie belyser värdet av biomarkörer för serummetaboliter för att bedöma risken för lungnoduler som upptäcks med datortomografi.
Tidig diagnos är avgörande för att förbättra överlevnaden för cancerpatienter. Resultat från den amerikanska nationella lungcancerscreeningsstudien (NLST) och den europeiska NELSON-studien har visat att screening med lågdos-datortomografi (LDCT) kan minska lungcancerdödligheten avsevärt i högriskgrupper1,2,3. Sedan den utbredda användningen av LDCT för lungcancerscreening har incidensen av tillfälliga radiografiska fynd av asymptomatiska lungnoduler fortsatt att öka4. Lungnoduler definieras som fokala opaciteter upp till 3 cm i diameter5. Vi har svårigheter att bedöma sannolikheten för malignitet och hantera det stora antalet lungnoduler som upptäcks av en slump på LDCT. Begränsningar med datortomografi kan leda till täta uppföljningsundersökningar och falskt positiva resultat, vilket leder till onödiga ingrepp och överbehandling6. Därför finns det ett behov av att utveckla tillförlitliga och användbara biomarkörer för att korrekt identifiera lungcancer i tidiga stadier och differentiera de flesta godartade noduler vid initial upptäckt7.
Omfattande molekylär analys av blod (serum, plasma, perifera mononukleära blodceller), inklusive genomik, proteomik eller DNA-metylering8,9,10, har lett till ett växande intresse för upptäckten av diagnostiska biomarkörer för lungcancer. Samtidigt mäter metabolomikmetoder cellulära slutprodukter som påverkas av endogena och exogena effekter och används därför för att förutsäga sjukdomsdebut och -resultat. Vätskekromatografi-tandemmasspektrometri (LC-MS) är en allmänt använd metod för metabolomikstudier på grund av dess höga känslighet och stora dynamiska omfång, vilket kan täcka metaboliter med olika fysikalisk-kemiska egenskaper11,12,13. Även om global metabolomisk analys av plasma/serum har använts för att identifiera biomarkörer associerade med lungcancerdiagnos14,15,16,17 och behandlingseffektivitet,18 återstår serummetabolitklassificerare för att skilja mellan godartade och maligna lungnoduler att studera mycket. - massiv forskning.
Adenocarcinom och skivepitelcancer är de två huvudsakliga subtyperna av icke-småcellig lungcancer (NSCLC). Olika CT-screeningtester indikerar att adenocarcinom är den vanligaste histologiska typen av lungcancer1,19,20,21. I denna studie använde vi ultraperformance liquid chromatography-high-resolution mass spectrometri (UPLC-HRMS) för att utföra metabolomikanalys på totalt 695 serumprover, inklusive friska kontroller, godartade lungnoduler och CT-detekterade ≤3 cm. Screening för lungadenokarcinom i stadium I. Vi identifierade en panel av serummetaboliter som skiljer lungadenokarcinom från godartade noduler och friska kontroller. Analys av anrikningsvägar visade att onormal tryptofan- och glukosmetabolism är vanliga förändringar i lungadenokarcinom jämfört med godartade noduler och friska kontroller. Slutligen etablerade och validerade vi en serummetabolisk klassificerare med hög specificitet och känslighet för att skilja mellan maligna och benigna lungnoduler detekterade med LDCT, vilket kan underlätta tidig differentialdiagnos och riskbedömning.
I den aktuella studien samlades serumprover matchade med kön och ålder retrospektivt in från 174 friska kontrollpersoner, 292 patienter med godartade lungnoduler och 229 patienter med lungadenokarcinom i stadium I. Demografiska egenskaper hos de 695 försökspersonerna visas i tilläggstabell 1.
Som visas i figur 1a samlades totalt 480 serumprover, inklusive 174 friska kontrollpersoner (HC), 170 benigna noduler (BN) och 136 lungadenokarcinomprover (LA) i stadium I, in vid Sun Yat-sen University Cancer Center. En upptäcktskohort för oriktad metabolomisk profilering med hjälp av ultraperformance liquid chromatography-high-resolution mass spectrometri (UPLC-HRMS). Som visas i kompletterande figur 1 identifierades differentiella metaboliter mellan LA och HC, LA och BN för att etablera en klassificeringsmodell och ytterligare utforska analys av differentiella signalvägar. 104 prover insamlade av Sun Yat-sen University Cancer Center och 111 prover insamlade av två andra sjukhus validerades internt respektive externt.
a Studiepopulation i upptäcktskohorten som genomgick global serummetabolomikanalys med hjälp av ultraperformandvätskekromatografi-högupplöst masspektrometri (UPLC-HRMS). b Partiell minstakvadratdiskriminantanalys (PLS-DA) av den totala metabolomen från 480 serumprover från studiekohorten, inklusive friska kontroller (HC, n = 174), benigna noduler (BN, n = 170) och lungadenokarcinom i stadium I (Los Angeles, n = 136). +ESI, positivt elektrosprayjoniseringsläge, -ESI, negativt elektrosprayjoniseringsläge. c–e Metaboliter med signifikant olika förekomster i två givna grupper (tvåsidigt Wilcoxon signed rank test, falskt upptäcktsfrekvensjusterat p-värde, FDR <0,05) visas i rött (faldig förändring > 1,2) och blått (faldig förändring < 0,83). ) visas på vulkangrafiken. f Hierarkisk klustervärmekarta som visar signifikanta skillnader i antalet kommenterade metaboliter mellan LA och BN. Källdata tillhandahålls i form av källdatafiler.
Den totala serummetabolomen för 174 HC, 170 BN och 136 LA i upptäcktsgruppen analyserades med hjälp av UPLC-HRMS-analys. Vi visar först att kvalitetskontrollprover (QC) klustrar tätt i mitten av en oövervakad principal component analysis (PCA)-modell, vilket bekräftar stabiliteten i den aktuella studiens prestanda (kompletterande figur 2).
Som visas i den partiella minstakvadratdiskriminantanalysen (PLS-DA) i figur 1b, fann vi att det fanns tydliga skillnader mellan LA och BN, LA och HC i positiva (+ESI) och negativa (-ESI) elektrosprayjoniseringslägen isolerat. Emellertid hittades inga signifikanta skillnader mellan BN och HC under +ESI- och -ESI-förhållanden.
Vi fann 382 differentiella egenskaper mellan LA och HC, 231 differentiella egenskaper mellan LA och BN, och 95 differentiella egenskaper mellan BN och HC (Wilcoxon signed rank test, FDR <0,05 och multipel förändring >1,2 eller <0,83) (Figur 1c-e). Topparna annoterades ytterligare (kompletterande data 3) mot en databas (mzCloud/HMDB/Chemspider-biblioteket) med m/z-värde, retentionstid och fragmenteringsmasspektrumsökning (detaljer beskrivs i metodavsnittet) 22. Slutligen identifierades 33 och 38 annoterade metaboliter med signifikanta skillnader i förekomst för LA kontra BN (Figur 1f och kompletterande tabell 2) respektive LA kontra HC (kompletterande figur 3 och kompletterande tabell 2). Däremot identifierades endast 3 metaboliter med signifikanta skillnader i förekomst i BN och HC (kompletterande tabell 2), vilket överensstämmer med överlappningen mellan BN och HC i PLS-DA. Dessa differentiella metaboliter täcker ett brett spektrum av biokemiska komponenter (kompletterande figur 4). Sammantaget visar dessa resultat signifikanta förändringar i serummetabolomet som återspeglar malign transformation av lungcancer i tidigt stadium jämfört med godartade lungnoduler hos friska individer. Samtidigt tyder likheten mellan serummetabolomet hos BN och HC på att godartade lungnoduler kan dela många biologiska egenskaper med friska individer. Med tanke på att epidermal growth factor receptor (EGFR) genmutationer är vanliga i lungadenokarcinom subtyp 23, försökte vi fastställa effekten av drivmutationer på serummetabolomet. Vi analyserade sedan den övergripande metabolomiska profilen hos 72 fall med EGFR-status i lungadenokarcinomgruppen. Intressant nog fann vi jämförbara profiler mellan EGFR-muterade patienter (n = 41) och EGFR vildtypspatienter (n = 31) i PCA-analys (kompletterande figur 5a). Vi identifierade dock 7 metaboliter vars förekomst var signifikant förändrad hos patienter med EGFR-mutation jämfört med patienter med vildtyps-EGFR (t-test, p < 0,05 och fold change > 1,2 eller < 0,83) (kompletterande figur 5b). Majoriteten av dessa metaboliter (5 av 7) är acylkarnitiner, vilka spelar en viktig roll i fettsyraoxidationsvägar.
Som illustreras i arbetsflödet som visas i figur 2a, erhölls biomarkörer för nodulklassificering med hjälp av minsta absoluta krympningsoperatorer och urval baserat på 33 differentiella metaboliter identifierade i LA (n = 136) och BN (n = 170). Bästa kombinationen av variabler (LASSO) – binär logistisk regressionsmodell. Tiofaldig korsvalidering användes för att testa modellens tillförlitlighet. Variabelval och parameterregularisering justeras med en sannolikhetsmaximeringsstraff med parameter λ24. Global metabolomikanalys utfördes vidare oberoende i grupperna för intern validering (n = 104) och extern validering (n = 111) för att testa klassificeringsprestanda för diskriminantmodellen. Som ett resultat identifierades 27 metaboliter i upptäcktsmängden som den bästa diskriminantmodellen med det största medelvärdet för AUC (Fig. 2b), varav 9 hade ökad aktivitet och 18 minskad aktivitet i LA jämfört med BN (Fig. 2c).
Arbetsflöde för att bygga en klassificerare för lungnoduler, inklusive att välja den bästa panelen av serummetaboliter i upptäcktsuppsättningen med hjälp av en binär logistisk regressionsmodell via tiofaldig korsvalidering och utvärdering av prediktiv prestanda i interna och externa valideringsuppsättningar. b Korsvalideringsstatistik för LASSO-regressionsmodellen för val av metaboliska biomarkörer. Siffrorna ovan representerar det genomsnittliga antalet biomarkörer som valts ut vid en given λ. Den röda prickade linjen representerar det genomsnittliga AUC-värdet vid motsvarande lambda. Grå felstaplar representerar de lägsta och högsta AUC-värdena. Den prickade linjen indikerar den bästa modellen med de 27 valda biomarkörerna. AUC, arean under ROC-kurvan (Receiver Operating Characteristic). c Viktiga förändringar av 27 utvalda metaboliter i LA-gruppen jämfört med BN-gruppen i upptäcktsgruppen. Röd kolumn – aktivering. Den blå kolumnen är en nedgång. d–f ROC-kurvor (Receiver Operating Characteristic) som visar diskriminantmodellens styrka baserat på 27 metabolitkombinationer i upptäckts-, interna och externa valideringsuppsättningar. Källdata tillhandahålls i form av källdatafiler.
En prediktionsmodell skapades baserad på de viktade regressionskoefficienterna för dessa 27 metaboliter (kompletterande tabell 3). ROC-analys baserad på dessa 27 metaboliter gav ett värde för arean under kurvan (AUC) på 0,933, en känslighet för upptäcktsgruppen var 0,868 och en specificitet var 0,859 (fig. 2d). Samtidigt, bland de 38 kommenterade differentiella metaboliterna mellan LA och HC, uppnådde en uppsättning av 16 metaboliter en AUC på 0,902 med en känslighet på 0,801 och en specificitet på 0,856 för att skilja LA från HC (kompletterande figur 6a-c). AUC-värden baserade på olika tröskelvärden för veckförändring för differentiella metaboliter jämfördes också. Vi fann att klassificeringsmodellen presterade bäst för att skilja mellan LA och BN (HC) när veckförändringsnivån var inställd på 1,2 kontra 1,5 eller 2,0 (kompletterande figur 7a, b). Klassificeringsmodellen, baserad på 27 metabolitgrupper, validerades ytterligare i interna och externa kohorter. AUC var 0,915 (känslighet 0,867, specificitet 0,811) för intern validering och 0,945 (känslighet 0,810, specificitet 0,979) för extern validering (Fig. 2e, f). För att bedöma interlaboratorieeffektiviteten analyserades 40 prover från den externa kohorten i ett externt laboratorium enligt beskrivningen i metodavsnittet. Klassificeringsnoggrannheten uppnådde en AUC på 0,925 (kompletterande figur 8). Eftersom lungskivepitelcancer (LUSC) är den näst vanligaste subtypen av icke-småcellig lungcancer (NSCLC) efter lungadenokarcinom (LUAD), testade vi också den validerade potentiella nyttan av metabola profiler. BN och 16 fall av LUSC. AUC för diskriminering mellan LUSC och BN var 0,776 (kompletterande figur 9), vilket indikerar sämre förmåga jämfört med diskriminering mellan LUAD och BN.
Studier har visat att storleken på noduler på datortomografibilder är positivt korrelerad med sannolikheten för malignitet och fortfarande är en viktig faktor för nodulbehandling25,26,27. Analys av data från den stora kohorten av NELSON-screeningstudien visade att risken för malignitet hos personer med noduler <5 mm var till och med likartad som hos personer utan noduler28. Därför är den minsta storleken som kräver regelbunden datortomografiövervakning 5 mm, enligt rekommendation av British Thoracic Society (BTS), och 6 mm, enligt rekommendation av Fleischner Society29. Noduler större än 6 mm och utan uppenbara godartade egenskaper, kallade obestämda pulmonella noduler (IPN), är dock fortfarande en stor utmaning vid utvärdering och behandling i klinisk praxis30,31. Vi undersökte sedan om nodulstorleken påverkade metaboliska signaturer med hjälp av poolade prover från upptäcktskohorterna och interna valideringskohorterna. Med fokus på 27 validerade biomarkörer jämförde vi först PCA-profilerna för HC- och BN-metabolomer sub-6 mm. Vi fann att de flesta datapunkterna för HC och BN överlappade varandra, vilket visar att serummetabolitnivåerna var likartade i båda grupperna (Fig. 3a). Funktionskartorna över olika storleksintervall förblev konserverade i BN och LA (Fig. 3b, c), medan en separation observerades mellan maligna och benigna noduler i intervallet 6–20 mm (Fig. 3d). Denna kohort hade en AUC på 0,927, en specificitet på 0,868 och en sensitivitet på 0,820 för att förutsäga maligniteten hos noduler som mätte 6 till 20 mm (Fig. 3e, f). Våra resultat visar att klassificeraren kan fånga metaboliska förändringar orsakade av tidig malign transformation, oavsett nodulstorlek.
ad Jämförelse av PCA-profiler mellan specificerade grupper baserat på en metabolisk klassificerare av 27 metaboliter. CC och BN < 6 mm. b BN < 6 mm vs BN 6–20 mm. i LA 6–20 mm vs LA 20–30 mm. g BN 6–20 mm och LA 6–20 mm. GC, n = 174; BN < 6 mm, n = 153; BN 6–20 mm, n = 91; LA 6–20 mm, n = 89; LA 20–30 mm, n = 77. e Receiver Operating Characteristic (ROC)-kurva som visar diskriminantmodellens prestanda för noduler 6–20 mm. f Sannolikhetsvärden beräknades baserat på den logistiska regressionsmodellen för noduler som mäter 6–20 mm. Den grå prickade linjen representerar det optimala gränsvärdet (0,455). Siffrorna ovan representerar andelen fall som beräknas för Los Angeles. Använd ett tvåsidigt Student's t-test. PCA, principal component analysis. AUC-arean under kurvan. Källdata tillhandahålls i form av källdatafiler.
Fyra prover (i åldern 44–61 år) med liknande storlekar på lungnoduler (7–9 mm) valdes vidare ut för att illustrera prestandan hos den föreslagna malignitetsprediktionsmodellen (Fig. 4a, b). Vid initial screening presenterade fall 1 sig som en solid nodul med förkalkning, ett särdrag förknippat med benignitet, medan fall 2 presenterade sig som en obestämd delvis solid nodul utan uppenbara benigna särdrag. Tre omgångar av uppföljande datortomografier visade att dessa fall förblev stabila under en 4-årsperiod och därför ansågs vara benigna noduler (Fig. 4a). Jämfört med klinisk utvärdering av seriella datortomografier identifierade engångs-serummetabolitanalys med den nuvarande klassificeringsmodellen snabbt och korrekt dessa benigna noduler baserat på probabilistiska begränsningar (Tabell 1). Figur 4b i fall 3 visar en nodul med tecken på pleuraretraktion, vilket oftast är förknippat med malignitet32. Fall 4 presenterade sig som en obestämd delvis solid nodul utan tecken på en benign orsak. Alla dessa fall förutspåddes som maligna enligt klassificeringsmodellen (tabell 1). Bedömningen av lungadenokarcinom demonstrerades genom histopatologisk undersökning efter lungresektionskirurgi (fig. 4b). För den externa valideringsmängden förutspådde den metabola klassificeraren korrekt två fall av obestämda lungnoduler större än 6 mm (kompletterande figur 10).
CT-bilder av lungornas axiella fönster vid två fall av godartade noduler. I fall 1 visade CT-skanning efter 4 år en stabil, solid nodul som mätte 7 mm med förkalkning i höger nedre lob. I fall 2 avslöjade CT-skanning efter 5 år en stabil, delvis solid nodul med en diameter på 7 mm i höger övre lob. b CT-bilder av lungorna med axiellt fönster och motsvarande patologiska studier av två fall av adenokarcinom i stadium I före lungresektion. Fall 3 visade en nodul med en diameter på 8 mm i höger övre lob med pleuraretraktion. Fall 4 visade en delvis solid glasmatt nodul som mätte 9 mm i vänster övre lob. Hematoxylin- och eosin (H&E)-färgning av resekerad lungvävnad (skalstapel = 50 μm) visar det acinära tillväxtmönstret för lungadenokarcinom. Pilar indikerar noduler som detekterats på CT-bilder. H&E-bilderna är representativa bilder av flera (>3) mikroskopiska fält som undersökts av patologen.
Sammantaget visar våra resultat det potentiella värdet av serummetabolitbiomarkörer vid differentialdiagnos av lungnoduler, vilket kan innebära utmaningar vid utvärdering av datortomografiscreening.
Baserat på en validerad differentiell metabolitpanel försökte vi identifiera biologiska korrelat av större metaboliska förändringar. KEGG-berikningsanalys av metabola reaktionsvägar utförd av MetaboAnalyst identifierade 6 gemensamma signifikant förändrade reaktionsvägar mellan de två givna grupperna (LA vs. HC och LA vs. BN, justerat p ≤ 0,001, effekt > 0,01). Dessa förändringar karakteriserades av störningar i pyruvatmetabolism, tryptofanmetabolism, niacin- och nikotinamidmetabolism, glykolys, TCA-cykeln och purinmetabolism (Fig. 5a). Vi utförde sedan vidare riktade metabolomikstudier för att verifiera större förändringar med hjälp av absolut kvantifiering. Bestämning av vanliga metaboliter i vanligt förändrade reaktionsvägar med trippel kvadrupolmasspektrometri (QQQ) med autentiska metabolitstandarder. Demografiska egenskaper hos målprovet från metabolomikstudien ingår i tilläggstabell 4. I överensstämmelse med våra globala metabolomikresultat bekräftade kvantitativ analys att hypoxantin och xantin, pyruvat och laktat var förhöjda i LA jämfört med BN och HC (Fig. 5b, c, p <0,05). Emellertid hittades inga signifikanta skillnader i dessa metaboliter mellan BN och HC.
KEGG-analys av anrikningsvägar för signifikant olika metaboliter i LA-gruppen jämfört med BN- och HC-grupperna. Ett tvåsidigt Globaltest användes och p-värden justerades med Holm-Bonferroni-metoden (justerat p ≤ 0,001 och effektstorlek > 0,01). b–d Fioldiagram som visar hypoxantin-, xantin-, laktat-, pyruvat- och tryptofannivåer i serum-HC, BN och LA bestämda med LC-MS/MS (n = 70 per grupp). Vita och svarta prickade linjer indikerar median respektive kvartil. e Fioldiagram som visar normaliserat Log2TPM (transkript per miljon) mRNA-uttryck av SLC7A5 och QPRT i lungadenokarcinom (n = 513) jämfört med normal lungvävnad (n = 59) i LUAD-TCGA-datasetet. Den vita rutan representerar interkvartilintervallet, den horisontella svarta linjen i mitten representerar medianen och den vertikala svarta linjen som sträcker sig från rutan representerar 95 % konfidensintervall (KI). f Pearson korrelationsdiagram över SLC7A5- och GAPDH-uttryck i lungadenokarcinom (n = 513) och normal lungvävnad (n = 59) i TCGA-datasetet. Det grå området representerar 95 % KI. r, Pearson korrelationskoefficient. g Normaliserade cellulära tryptofannivåer i A549-celler transfekterade med ospecifik shRNA-kontroll (NC) och shSLC7A5 (Sh1, Sh2) bestämda med LC-MS/MS. Statistisk analys av fem biologiskt oberoende prover i varje grupp presenteras. h Cellulära nivåer av NADt (total NAD, inklusive NAD+ och NADH) i A549-celler (NC) och SLC7A5 knockdown A549-celler (Sh1, Sh2). Statistisk analys av tre biologiskt oberoende prover i varje grupp presenteras. i Glykolytisk aktivitet hos A549-celler före och efter SLC7A5-nedläggning mättes med extracellulär försurningshastighet (ECAR) (n = 4 biologiskt oberoende prover per grupp). 2-DG,2-deoxi-D-glukos. Tvåsidigt Student's t-test användes i (b–h). I (g–i) representerar felstaplarna medelvärdet ± SD, varje experiment utfördes tre gånger oberoende av varandra och resultaten var likartade. Källdata tillhandahålls i form av källdatafiler.
Med tanke på den signifikanta effekten av förändrad tryptofanmetabolism i LA-gruppen, bedömde vi även serumtryptofannivåerna i HC-, BN- och LA-grupperna med hjälp av QQQ. Vi fann att serumtryptofan var reducerat i LA jämfört med HC eller BN (p < 0,001, figur 5d), vilket överensstämmer med tidigare fynd att cirkulerande tryptofannivåer är lägre hos patienter med lungcancer än hos friska kontroller från kontrollgruppen33,34,35. En annan studie med PET/CT-spårämnet 11C-metyl-L-tryptofan fann att tryptofansignalretentionstiden i lungcancervävnad var signifikant ökad jämfört med godartade lesioner eller normal vävnad36. Vi antar att minskningen av tryptofan i LA-serum kan återspegla aktivt tryptofanupptag av lungcancerceller.
Det är också känt att slutprodukten av kynureninvägen för tryptofankatabolism är NAD+37,38, vilket är ett viktigt substrat för reaktionen mellan glyceraldehyd-3-fosfat och 1,3-bisfosfoglycerat i glykolys39. Medan tidigare studier har fokuserat på tryptofankatabolismens roll i immunreglering, försökte vi belysa samspelet mellan tryptofandysreglering och glykolytiska vägar som observerades i den aktuella studien. Solut transporter family 7 member 5 (SLC7A5) är känd för att vara en tryptofantransportör43,44,45. Kinolinsyrafosforibosyltransferas (QPRT) är ett enzym som ligger nedströms kynureninvägen som omvandlar kinolinsyra till NAMN46. Inspektion av LUAD TCGA-datasetet visade att både SLC7A5 och QPRT var signifikant uppreglerade i tumörvävnad jämfört med normal vävnad (Fig. 5e). Denna ökning observerades i stadium I och II samt stadium III och IV av lungadenokarcinom (kompletterande figur 11), vilket indikerar tidiga störningar i tryptofanmetabolismen i samband med tumörbildning.
Dessutom visade LUAD-TCGA-datasetet en positiv korrelation mellan SLC7A5 och GAPDH mRNA-uttryck i cancerpatientprover (r = 0,45, p = 1,55E-26, figur 5f). Däremot hittades ingen signifikant korrelation mellan sådana gensignaturer i normal lungvävnad (r = 0,25, p = 0,06, figur 5f). Nedbrytning av SLC7A5 (kompletterande figur 12) i A549-celler minskade signifikant cellulära tryptofan- och NAD(H)-nivåer (figur 5g,h), vilket resulterade i försvagad glykolytisk aktivitet mätt med extracellulär försurningshastighet (ECAR) (figur 1). 5i). Baserat på metaboliska förändringar i serum och in vitro-detektion antar vi således att tryptofanmetabolism kan producera NAD+ genom kynureninvägen och spela en viktig roll för att främja glykolys i lungcancer.
Studier har visat att ett stort antal obestämda lungnoduler som upptäcks med LDCT kan leda till behov av ytterligare tester såsom PET-CT, lungbiopsi och överbehandling på grund av en falskt positiv diagnos av malignitet.31 Som visas i figur 6 identifierade vår studie en panel av serummetaboliter med potentiellt diagnostiskt värde som kan förbättra riskstratifiering och efterföljande hantering av lungnoduler som upptäcks med CT.
Lungnoduler utvärderas med lågdos-datortomografi (LDCT) med avbildningsfunktioner som tyder på benign eller malign orsak. Det osäkra resultatet av noduler kan leda till täta uppföljningsbesök, onödiga interventioner och överbehandling. Införandet av serummetaboliska klassificerare med diagnostiskt värde kan förbättra riskbedömningen och den efterföljande behandlingen av lungnoduler. PET-positronemissionstomografi.
Data från den amerikanska NLST-studien och den europeiska NELSON-studien tyder på att screening av högriskgrupper med lågdosdatortomografi (LDCT) kan minska dödligheten i lungcancer1,3. Riskbedömning och efterföljande klinisk behandling av ett stort antal tillfälliga lungnoduler som upptäcks med LDCT är dock fortfarande den mest utmanande. Huvudmålet är att optimera korrekt klassificering av befintliga LDCT-baserade protokoll genom att införliva tillförlitliga biomarkörer.
Vissa molekylära biomarkörer, såsom blodmetaboliter, har identifierats genom att jämföra lungcancer med friska kontrollpersoner15,17. I den aktuella studien fokuserade vi på tillämpningen av serummetabolomikanalys för att skilja mellan benigna och maligna lungnoduler som av en slump upptäckts med LDCT. Vi jämförde den globala serummetabolomen hos frisk kontrollperson (HC), benigna lungnoduler (BN) och lungadenokarcinom (LA) i stadium I med hjälp av UPLC-HRMS-analys. Vi fann att HC och BN hade liknande metaboliska profiler, medan LA visade signifikanta förändringar jämfört med HC och BN. Vi identifierade två uppsättningar serummetaboliter som skiljer LA från HC och BN.
Det nuvarande LDCT-baserade identifieringsschemat för godartade och maligna noduler baseras huvudsakligen på nodulernas storlek, densitet, morfologi och tillväxthastighet över tid30. Tidigare studier har visat att nodulernas storlek är nära relaterad till sannolikheten för lungcancer. Även hos högriskpatienter är risken för malignitet i noduler <6 mm <1 %. Risken för malignitet för noduler som mäter 6 till 20 mm varierar från 8 % till 64 %30. Därför rekommenderar Fleischner Society en gränsdiameter på 6 mm för rutinmässig datortomografisk uppföljning.29 Riskbedömning och behandling av obestämda lungnoduler (IPN) större än 6 mm har dock inte utförts adekvat31. Nuvarande behandling av medfödd hjärtsjukdom baseras vanligtvis på vaksam avvaktan med frekvent datortomografisk övervakning.
Baserat på det validerade metabolomet visade vi för första gången överlappningen av metabolomiska signaturer mellan friska individer och benigna noduler <6 mm. Den biologiska likheten överensstämmer med tidigare CT-fynd att risken för malignitet för noduler <6 mm är lika låg som för personer utan noduler.30 Det bör noteras att våra resultat också visar att benigna noduler <6 mm och ≥6 mm har hög likhet i metabolomiska profiler, vilket tyder på att den funktionella definitionen av benign etiologi är konsekvent oavsett nodulstorlek. Således kan moderna diagnostiska serummetabolitpaneler tillhandahålla en enda analys som ett uteslutningstest när noduler initialt detekteras på CT och potentiellt minska seriell övervakning. Samtidigt skilde samma panel av metaboliska biomarkörer maligna noduler ≥6 mm i storlek från benigna noduler och gav noggranna förutsägelser för IPN av liknande storlek och tvetydiga morfologiska egenskaper på CT-bilder. Denna serummetabolismklassificerare presterade bra för att förutsäga maligniteten hos noduler ≥6 mm med en AUC på 0,927. Sammantaget indikerar våra resultat att unika serummetabolomiska signaturer specifikt kan återspegla tidiga tumörinducerade metaboliska förändringar och ha potentiellt värde som riskprediktorer, oberoende av nodulstorlek.
Det är värt att notera att lungadenokarcinom (LUAD) och skivepitelcancer (LUSC) är de viktigaste typerna av icke-småcellig lungcancer (NSCLC). Med tanke på att LUSC är starkt associerat med tobaksbruk47 och LUAD är den vanligaste histologin för tillfälliga lungnoduler som detekteras vid datortomografiscreening48, byggdes vår klassificeringsmodell specifikt för adenokarcinomprover i stadium I. Wang och kollegor fokuserade också på LUAD och identifierade nio lipidsignaturer med hjälp av lipidomik för att skilja lungcancer i tidigt stadium från friska individer17. Vi testade den nuvarande klassificeringsmodellen på 16 fall av LUSC i stadium I och 74 benigna noduler och observerade låg prediktionsnoggrannhet för LUSC (AUC 0,776), vilket tyder på att LUAD och LUSC kan ha sina egna metabolomiska signaturer. Faktum är att LUAD och LUSC har visat sig skilja sig åt i etiologi, biologiskt ursprung och genetiska avvikelser49. Därför bör andra typer av histologi inkluderas i träningsmodeller för populationsbaserad detektion av lungcancer i screeningprogram.
Här identifierade vi de sex vanligast förändrade metaboliterna i lungadenokarcinom jämfört med friska kontroller och godartade noduler. Xantin och hypoxantin är vanliga metaboliter i purinmetabolismen. I överensstämmelse med våra resultat var intermediärer associerade med purinmetabolism signifikant förhöjda i serum eller vävnader hos patienter med lungadenokarcinom jämfört med friska kontroller eller patienter i preinvasivt stadium15,50. Förhöjda serumnivåer av xantin och hypoxantin kan återspegla den anabolism som krävs av snabbt prolifererande cancerceller. Dysreglering av glukosmetabolismen är ett välkänt kännetecken för cancermetabolism51. Här observerade vi en signifikant ökning av pyruvat och laktat i LA-gruppen jämfört med HC- och BN-gruppen, vilket överensstämmer med tidigare rapporter om avvikelser i glykolytiska vägar i serummetabolomprofilerna hos patienter med icke-småcellig lungcancer (NSCLC) och friska kontroller. Resultaten är överensstämmande52,53.
Viktigt är att vi observerade en omvänd korrelation mellan pyruvat- och tryptofanmetabolism i serum från lungadenokarcinom. Serumtryptofannivåerna var reducerade i LA-gruppen jämfört med HC- eller BN-gruppen. Intressant nog fann en tidigare storskalig studie med en prospektiv kohort att låga nivåer av cirkulerande tryptofan var associerade med en ökad risk för lungcancer 54. Tryptofan är en essentiell aminosyra som vi får helt från mat. Vi drar slutsatsen att serumtryptofanbrist vid lungadenokarcinom kan återspegla snabb utarmning av denna metabolit. Det är välkänt att slutprodukten av tryptofankatabolism via kynureninvägen är källan till de novo NAD+-syntes. Eftersom NAD+ produceras huvudsakligen genom bärgningsvägen, återstår betydelsen av NAD+ i tryptofanmetabolismen för hälsa och sjukdom att fastställa 46. Vår analys av TCGA-databasen visade att uttrycket av tryptofantransportören 7A5 (SLC7A5) var signifikant förhöjt i lungadenokarcinom jämfört med normala kontroller och var positivt korrelerat med uttrycket av det glykolytiska enzymet GAPDH. Tidigare studier har huvudsakligen fokuserat på tryptofankatabolismens roll i att undertrycka det antitumörrelaterade immunsvaret40,41,42. Här visar vi att hämning av tryptofanupptag genom nedreglering av SLC7A5 i lungcancerceller resulterar i en efterföljande minskning av cellulära NAD-nivåer och en samtidig minskning av glykolytisk aktivitet. Sammanfattningsvis ger vår studie en biologisk grund för förändringar i serummetabolismen i samband med malign transformation av lungadenokarcinom.
EGFR-mutationer är de vanligaste drivmutationerna hos patienter med icke-småcellig lungcancer (NSCLC). I vår studie fann vi att patienter med EGFR-mutation (n = 41) hade liknande metaboliska profiler som patienter med vildtyps-EGFR (n = 31), även om vi fann minskade serumnivåer hos vissa patienter med EGFR-mutation hos acylkarnitinpatienter. Acylkarnitiners etablerade funktion är att transportera acylgrupper från cytoplasman till mitokondriell matrix, vilket leder till oxidation av fettsyror för att producera energi 55. I överensstämmelse med våra resultat identifierade en nyligen genomförd studie också liknande metabolomprofiler mellan EGFR-mutant- och EGFR-vildtypstumörer genom att analysera den globala metabolomen från 102 lungadenokarcinomvävnadsprover 50. Intressant nog hittades acylkarnitininnehåll också i EGFR-mutantgruppen. Därför kan det vara värt att studera vidare huruvida förändringar i acylkarnitinnivåer återspeglar EGFR-inducerade metaboliska förändringar och de underliggande molekylära vägarna.
Sammanfattningsvis etablerar vår studie en serummetabolisk klassificerare för differentialdiagnos av lungnoduler och föreslår ett arbetsflöde som kan optimera riskbedömning och underlätta klinisk behandling baserat på datortomografi-screening.
Denna studie godkändes av etikkommittén vid Sun Yat-sen University Cancer Hospital, First Affiliated Hospital vid Sun Yat-sen University och etikkommittén vid Zhengzhou University Cancer Hospital. I grupperna för upptäckt och intern validering samlades 174 sera från friska individer och 244 sera från benigna noduler in från individer som genomgick årliga läkarundersökningar vid avdelningen för cancerkontroll och förebyggande åtgärder, Sun Yat-sen University Cancer Center, och 166 benigna noduler i serum samlades in. Lungadenokarcinom i stadium I samlades in från Sun Yat-sen University Cancer Center. I den externa valideringskohorten fanns 48 fall av benigna noduler, 39 fall av lungadenokarcinom i stadium I från First Affiliated Hospital vid Sun Yat-sen University och 24 fall av lungadenokarcinom i stadium I från Zhengzhou Cancer Hospital. Sun Yat-sen University Cancer Center samlade också in 16 fall av skivepitelcancer i stadium I för att testa den diagnostiska förmågan hos den etablerade metabola klassificeraren (patientkarakteristika visas i tilläggstabell 5). Prover från upptäcktskohorten och den interna valideringskohorten samlades in mellan januari 2018 och maj 2020. Prover för den externa valideringskohorten samlades in mellan augusti 2021 och oktober 2022. För att minimera könsbias tilldelades ungefär lika många manliga och kvinnliga fall till varje kohort. Upptäcktsteam och internt granskningsteam. Deltagarnas kön bestämdes baserat på självrapportering. Informerat samtycke erhölls från alla deltagare och ingen kompensation gavs. Försökspersoner med benigna noduler var de med en stabil datortomografipoäng vid 2 till 5 år vid tidpunkten för analys, förutom 1 fall från det externa valideringsprovet, som samlades in preoperativt och diagnostiserades med histopatologi. Med undantag för kronisk bronkit. Fall av lungadenokarcinom samlades in före lungresektion och bekräftades genom patologisk diagnos. Fastande blodprover samlades in i serumseparationsrör utan antikoagulantia. Blodproverna koagulerades i 1 timme vid rumstemperatur och centrifugerades sedan vid 2851 × g i 10 minuter vid 4 °C för att samla serumsupernatant. Serumalikvoter frystes vid -80 °C tills metaboliter extraherades. Avdelningen för cancerprevention och medicinsk undersökning vid Sun Yat-sen University Cancer Center samlade in en pool av serum från 100 friska donatorer, inklusive lika många män och kvinnor i åldrarna 40 till 55 år. Lika volymer av varje donatorprov blandades, den resulterande poolen alikvoterades och förvarades vid -80 °C. Serumblandningen användes som referensmaterial för kvalitetskontroll och datastandardisering.
Referensserum och testprover tinades och metaboliter extraherades med en kombinerad extraktionsmetod (MTBE/metanol/vatten) 56. Kortfattat blandades 50 μl serum med 225 μl iskall metanol och 750 μl iskall metyl-tert-butyleter (MTBE). Rör om blandningen och inkubera på is i 1 timme. Proverna blandades sedan och vortexblandades med 188 μl MS-kvalitetsvatten innehållande interna standarder (13C-laktat, 13C3-pyruvat, 13C-metionin och 13C6-isoleucin, köpta från Cambridge Isotope Laboratories). Blandningen centrifugerades sedan vid 15 000 × g i 10 minuter vid 4 °C, och den nedre fasen överfördes till två rör (125 μl vardera) för LC-MS-analys i positivt och negativt läge. Slutligen indunstades provet till torrhet i en höghastighetsvakuumkoncentrator.
De torkade metaboliterna rekonstituerades i 120 μl 80 % acetonitril, virvlades i 5 minuter och centrifugerades vid 15 000 × g i 10 minuter vid 4 °C. Supernatanten överfördes till bärnstensfärgade glasampuller med mikroinsatser för metabolomikstudier. Oriktad metabolomikanalys på en plattform för ultraperformant vätskekromatografi med hög upplösning och masspektrometri (UPLC-HRMS). Metaboliterna separerades med hjälp av ett Dionex Ultimate 3000 UPLC-system och en ACQUITY BEH Amide-kolonn (2,1 × 100 mm, 1,7 μm, Waters). I positivt jonläge var de mobila faserna 95 % (A) och 50 % acetonitril (B), vardera innehållande 10 mmol/L ammoniumacetat och 0,1 % myrsyra. I negativt läge innehöll de mobila faserna A och B 95 % respektive 50 % acetonitril, båda faserna innehöll 10 mmol/L ammoniumacetat, pH = 9. Gradientprogrammet var följande: 0–0,5 min, 2 % B; 0,5–12 min, 2–50 % B; 12–14 min, 50–98 % B; 14–16 min, 98 % B; 16–16,1 min, 98–2 % B; 16,1–20 min, 2 % B. Kolonnen hölls vid 40 °C och provet vid 10 °C i autosamplern. Flödeshastigheten var 0,3 ml/min, injektionsvolymen var 3 μl. En Q-Exactive Orbitrap-masspektrometer (Thermo Fisher Scientific) med en elektrosprayjoniseringskälla (ESI) användes i fullskanningsläge och kopplades till ddMS2-övervakningsläget för att samla in stora datamängder. MS-parametrarna ställdes in enligt följande: sprayspänning +3,8 kV/- 3,2 kV, kapillärtemperatur 320 °C, skyddsgas 40 arb, hjälpgas 10 arb, sondvärmartemperatur 350 °C, skanningsområde 70–1050 m/h, upplösning 70 000. Data erhölls med Xcalibur 4.1 (Thermo Fisher Scientific).
För att bedöma datakvaliteten genererades poolade kvalitetskontrollprover (QC) genom att ta 10 μL alikvoter av supernatanten från varje prov. Sex injektioner av kvalitetskontrollprover analyserades i början av den analytiska sekvensen för att bedöma stabiliteten hos UPLC-MS-systemet. Kvalitetskontrollprover introducerades sedan regelbundet i batchen. Alla 11 batcher av serumprover i denna studie analyserades med LC-MS. Alikvoter av en serumpoolblandning från 100 friska donatorer användes som referensmaterial i respektive batcher för att övervaka extraktionsprocessen och justera för effekter från batch till batch. Oriktad metabolomikanalys av upptäcktskohorten, den interna valideringskohorten och den externa valideringskohorten utfördes vid Metabolomics Center vid Sun Yat-sen University. Det externa laboratoriet vid Guangdong University of Technology Analysis and Testing Center analyserade också 40 prover från den externa kohorten för att testa klassificeringsmodellens prestanda.
Efter extraktion och rekonstitution mättes absolut kvantifiering av serummetaboliter med hjälp av ultrahögpresterande vätskekromatografi-tandemmasspektrometri (Agilent 6495 trippelkvadrupol) med en elektrosprayjoniseringskälla (ESI) i multipel reaktionsövervakningsläge (MRM). En ACQUITY BEH-amidkolonn (2,1 × 100 mm, 1,7 μm, Waters) användes för att separera metaboliter. Den mobila fasen bestod av 90 % (A) och 5 % acetonitril (B) med 10 mmol/L ammoniumacetat och 0,1 % ammoniaklösning. Gradientprogrammet var följande: 0–1,5 min, 0 % B; 1,5–6,5 min, 0–15 % B; 6,5–8 min, 15 % B; 8–8,5 min, 15 %–0 % B; 8,5–11,5 min, 0 % B. Kolonnen hölls vid 40 °C och provet vid 10 °C i autosamplern. Flödeshastigheten var 0,3 ml/min och injektionsvolymen var 1 μL. MS-parametrar inställdes enligt följande: kapillärspänning ±3,5 kV, nebulisatortryck 35 psi, mantelgasflöde 12 L/min, mantelgastemperatur 350 °C, torkgastemperatur 250 °C och torkgasflöde 14 l/min. MRM-omvandlingarna av tryptofan, pyruvat, laktat, hypoxantin och xantin var 205,0–187,9, 87,0–43,4, 89,0–43,3, 135,0–92,3 respektive 151,0–107,9. Data samlades in med Mass Hunter B.07.00 (Agilent Technologies). För serumprover kvantifierades tryptofan, pyruvat, laktat, hypoxantin och xantin med hjälp av kalibreringskurvor för standardblandningar. För cellprover normaliserades tryptofanhalten till den interna standarden och cellproteinmassan.
Toppextraktion (m/z och retentionstid (RT)) utfördes med Compound Discovery 3.1 och TraceFinder 4.0 (Thermo Fisher Scientific). För att eliminera potentiella skillnader mellan batcher dividerades varje karakteristisk topp i testprovet med den karakteristiska toppen för referensmaterialet från samma batch för att erhålla den relativa förekomsten. De relativa standardavvikelserna för interna standarder före och efter standardisering visas i tilläggstabell 6. Skillnaderna mellan de två grupperna karakteriserades av falsk upptäcktsfrekvens (FDR < 0,05, Wilcoxon signed rank test) och fold change (> 1,2 eller < 0,83). Rådata för MS för de extraherade egenskaperna och referensserumkorrigerade MS-data visas i tilläggsdata 1 respektive tilläggsdata 2. Toppannotering utfördes baserat på fyra definierade identifieringsnivåer, inklusive identifierade metaboliter, förmodat annoterade föreningar, förmodat karakteriserade föreningsklasser och okända föreningar 22. Baserat på databassökningar i Compound Discovery 3.1 (mzCloud, HMDB, Chemspider) valdes slutligen biologiska föreningar med MS/MS-matchande validerade standarder eller exakta matchningsannoteringar i mzCloud (poäng > 85) eller Chemspider som intermediärer mellan de differentiella metabolomen. Toppannoteringar för varje funktion ingår i kompletterande data 3. MetaboAnalyst 5.0 användes för univariat analys av sum-normaliserad metabolitförekomst. MetaboAnalyst 5.0 utvärderade också KEGG-vägsanrikningsanalys baserat på signifikant olika metaboliter. Principal component analysis (PCA) och partial least squares discriminant analysis (PLS-DA) analyserades med hjälp av programvarupaketet ropls (v.1.26.4) med stacknormalisering och autoskalning. Den optimala metabolitbiomarkörmodellen för att förutsäga nodulmalignitet genererades med hjälp av binär logistisk regression med minsta absoluta krympning och selektionsoperator (LASSO, R-paket v.4.1-3). Diskriminantmodellens prestanda i detektions- och valideringsuppsättningarna karakteriserades genom att uppskatta AUC baserat på ROC-analys enligt pROC-paketet (v.1.18.0.). Det optimala sannolikhetsgränsvärdet erhölls baserat på modellens maximala Youden-index (känslighet + specificitet – 1). Prover med värden lägre eller högre än tröskelvärdet kommer att förutsägas som benigna noduler respektive lungadenokarcinom.
A549-celler (#CCL-185, American Type Culture Collection) odlades i F-12K-medium innehållande 10 % FBS. Korta hårnåls-RNA (shRNA)-sekvenser riktade mot SLC7A5 och en icke-riktad kontroll (NC) insattes i den lentivirala vektorn pLKO.1-puro. Antisenssekvenserna för shSLC7A5 är följande: Sh1 (5′-GGAGAAACCTGATGAACAGTT-3′), Sh2 (5′-GCCGTGGACTTCGGGAACTAT-3′). Antikroppar mot SLC7A5 (#5347) och tubulin (#2148) köptes från Cell Signaling Technology. Antikroppar mot SLC7A5 och tubulin användes i en utspädning av 1:1000 för Western blot-analys.
Seahorse XF glykolytiskt stresstest mäter nivåerna av extracellulär försurning (ECAR). I analysen administrerades glukos, oligomycin A och 2-DG sekventiellt för att testa cellulär glykolytisk kapacitet mätt med ECAR.
A549-celler transfekterade med icke-målsökande kontroll (NC) och shSLC7A5 (Sh1, Sh2) placerades över natten i skålar med 10 cm diameter. Cellmetaboliter extraherades med 1 ml iskall 80% vattenlösning av metanol. Celler i metanollösningen skrapades av, samlades in i ett nytt rör och centrifugerades vid 15 000 × g i 15 minuter vid 4 °C. Samla in 800 µl supernatant och torka med en höghastighetsvakuumkoncentrator. De torkade metabolitpelletsen analyserades sedan med avseende på tryptofannivåer med hjälp av LC-MS/MS enligt beskrivningen ovan. Cellulära NAD(H)-nivåer i A549-celler (NC och shSLC7A5) mättes med hjälp av ett kvantitativt NAD+/NADH kolorimetriskt kit (#K337, BioVision) enligt tillverkarens instruktioner. Proteinnivåer mättes för varje prov för att normalisera mängden metaboliter.
Inga statistiska metoder användes för att preliminärt bestämma urvalsstorleken. Tidigare metabolomikstudier som syftade till att upptäcka biomarkörer15,18 har betraktats som riktmärken för storleksbestämning, och jämfört med dessa rapporter var vårt urval adekvat. Inga prover exkluderades från studiekohorten. Serumprover tilldelades slumpmässigt till en upptäcktsgrupp (306 fall, 74,6%) och en intern valideringsgrupp (104 fall, 25,4%) för oriktade metabolomikstudier. Vi valde också slumpmässigt 70 fall från varje grupp från upptäcktsmängden för riktade metabolomikstudier. Forskarna var blinda för grupptilldelning under LC-MS-datainsamling och -analys. Statistiska analyser av metabolomikdata och cellexperiment beskrivs i respektive avsnitt Resultat, Figurförklaringar och Metoder. Kvantifiering av cellulär tryptofan, NADT och glykolytisk aktivitet utfördes tre gånger oberoende av varandra med identiska resultat.
För mer information om studiedesignen, se Natural Portfolio Report Abstract som är kopplat till den här artikeln.
Rådata från MS för de extraherade egenskaperna och normaliserade MS-data för referensserumet visas i kompletterande data 1 respektive kompletterande data 2. Toppannoteringar för differentiella egenskaper presenteras i kompletterande data 3. LUAD TCGA-datasetet kan laddas ner från https://portal.gdc.cancer.gov/. Indata för att plotta grafen finns i källdata. Källdata tillhandahålls för denna artikel.
Nationella studiegruppen för lungscreening, etc. Minska dödligheten i lungcancer med lågdoserad datortomografi. Northern England. J. Med. 365, 395–409 (2011).
Kramer, BS, Berg, KD, Aberle, DR och Prophet, PC. Lungcancerscreening med lågdos spiral-CT: resultat från National Lung Screening Study (NLST). J. Med. Screen 18, 109–111 (2011).
De Koning, HJ, et al. Minskning av lungcancerdödlighet med volumetrisk datortomografiscreening i en randomiserad studie. Northern England. J. Med. 382, 503–513 (2020).
Publiceringstid: 18 sep-2023