CRISPR) är en tredje generationens genomredigeringsteknik: CRISPR revolutionerade världen

Clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR) är en tredje generationens genomredigeringsteknik som har revolutionerat världen med sina högkapacitetsresultat. Den har använts för att behandla olika biologiska sjukdomar och infektioner. Olika bakterier och andra prokaryoter (såsom arkéer) har också CRISPR/Cas9-system för att försvara sig mot fager. Det har rapporterats att CRISPR/Cas9-baserade strategier kan hämma tillväxten och utvecklingen av trippelnegativ bröstcancer (TNBC) genom att rikta in sig på potentiellt förändrade resistensgener, transkription och epigenetisk reglering. Dessa terapeutiska interventioner kan hjälpa till att ta itu med utmanande problem som läkemedelsresistens som observerats även vid TNBC. För närvarande används olika metoder för att leverera CRISPR/Cas9 till målceller, såsom fysiska (mikroinjektion, elektroporation och hydrodynamiska lägen), virala (adenoassocierat virus och lentivirus) och icke-virala (liposomer och lipidnanopartiklar). Även om olika modeller har utvecklats för att studera de molekylära orsakerna till TNBC, begränsar bristen på känsliga och riktade metoder för att leverera genomredigeringsverktyg in vivo deras kliniska tillämpning. Sammanfattningsvis undersöker denna översikt ingående framstegen, utmaningarna, begränsningarna och utsikterna för CRISPR/Cas9-behandling för TNBC baserat på befintlig evidens. Vi belyser också hur kombinationen av artificiell intelligens och maskininlärning kan förbättra CRISPR/Cas9-strategier vid behandling av TNBC.
Cancer kännetecknas av okontrollerad celldelning, störningar i cellcykelns kontrollpunkter och mutationer i tumörsuppressorgener (TSG) (Matthews et al., 2022). Bland de olika typerna av cancer är bröstcancer den vanligaste cancertypen hos kvinnor och har en hög dödlighet världen över (Waks och Winer, 2019). Bröstcancer är en heterogen sjukdom med olika egenskaper, såsom histologiska och biologiska egenskaper, klinisk presentation och beteende, samt svar på behandling (Weigelt et al., 2010). Klassificering av bröstcancer ger exakta insikter för diagnos av bröstcancer och tumörprognos. Användningen av vanliga biomarkörer och klinisk-patologiska egenskaper har varit det viktigaste kriteriet för klassificering av bröstcancer (Tsang och Tse, 2019). Prognosen och svaret på behandling av bröstcancer påverkas av många faktorer, inklusive förekomsten av östrogenreceptor (ER), progesteronreceptor (PR), human epidermal growth factor receptor 2 (HER2/neu) samt histologisk grad, tumörtyp och grad. storlek och lymfkörtelmetastasering (Al-Tubaiti, 2020). Fem inneboende molekylära subtyper av bröstcancer har identifierats, inklusive luminal A, luminal B, HER2-berikad, basalliknande och claudin-låg (Prat et al., 2015). TNBC är en molekylär subtyp av cancer som inte uttrycker alla ER, PR och HER2 (Yin et al., 2020). Dessa patologiska egenskaper är associerade med TNBC, vilket bekräftar dess snabba progression och mer aggressiva natur än någon annan typ av bröstcancer (Feng et al., 2018). Dessutom använde Peru et al (2000) microarray-teknik för att omklassificera bröstcancer och identifiera fem inneboende subtyper av bröstcancer (Cadenas, 2012). Basalliknande bröstcancer är en subtyp av bröstcancer som har en trippelnegativ fenotyp och är associerad med snabb progression. Det bör noteras att alla basalliknande bröstcancerformer ofta feldiagnostiseras som TNBC, men endast 77 % är TNBC. Däremot är 71–91 % av TNBC basalliknande, vilket indikerar att dessa två typer av bröstcancer överlappar varandra och representerar olika klassificeringar (Wang D.-Y. et al., 2019). Detta skapar ett behov av att karakterisera heterogeniteten hos TNBC för att belysa prognosen och identifiera potentiella svar på nuvarande och framtida behandlingar. Dessutom står TNBC för 15–20 % av alla bröstcancerfall och är vanligare hos kvinnor under 50 år. BRCA1- eller BRCA2-mutationer har rapporterats i cirka 20 % av TNBC-fallen (Xie et al., 2017; Tzikas et al., 2017, 2020). Studier har också visat att TNBC har en distinkt immunmikromiljö som inkluderar höga nivåer av vaskulära endoteltillväxtfaktorer, tumörassocierade makrofager (TAM), tumörinfiltrerande lymfocyter (TIL) och andra molekyler involverade i tumörtillväxt och migration. Därför är det avgörande att förstå mikromiljön för TNBC för dess prognos och behandling (Fan och He, 2022).
För att bedöma prognosen för TNBC och säkerställa effektiv behandling är det viktigt med korrekt diagnos, huvudsakligen baserad på immunhistokemi (IHC) för att detektera ER, PR och HER2, och mammografi för att detektera brösttumörer. Mammografi kan dock inte tillräckligt avbilda intratumorala egenskaper som nekros och fibros (Deepak Singh et al., 2021). Eftersom dålig prognos och diagnos hindrar läkare från att förskriva rätt läkemedel (Chaudhary, 2020) används olika strategier för att förbättra vården för patienter med TNBC. För närvarande används två läkemedel, doxorubicin och cyklofosfamid, hos patienter med TNBC och har visat goda resultat. Dessutom används andra platinabaserade läkemedel, såsom karboplatin och cisplatin (Sikov et al., 2015). Dessutom har PARP-hämmare såsom Olaparib, Velaparib och PF-01367338 använts som potentiella kemoterapiläkemedel för behandling av TNBC (Ishino et al., 2018). Eftersom signalvägarna Wnt/b-Catenin, NOTCH och Hedgehog har rapporterats vara involverade i uppkomsten och utvecklingen av TNBC, kan det vara en viktig strategi att rikta läkemedel mot dessa signalvägar (Aysola et al., 2013). Även om kirurgi, strålbehandling och kemoterapi fortfarande är grunden för behandling av TNBC idag, har betydande framsteg gjorts i utvecklingen av nya behandlingar, inklusive riktad terapi, immunterapi, olika CRISPR-relaterade genredigeringsverktyg såsom Cas9n, dCas9, CRISPR/Cas12, prime editing och CRISPR/Cas9-riktad genterapi. Här kommer vi att fokusera på olika CRISPR-relaterade genredigeringsverktyg som används vid behandling av TNBC. Bland dem har CRISPR/Cas9 fått stor uppmärksamhet.
Cas9n, även känt som Cas9-nickase, är en genetiskt modifierad variant av Cas9-proteinet som härrör från CRISPR/Cas9-genomredigeringssystemet (Gupta et al., 2019). I sin ursprungliga form innehåller Cas9-proteinet två nukleasdomäner: RuvC och HNH, vars huvudsakliga funktion är klyvning av båda DNA-strängarna. I Cas9n är dock en av nukleasdomänerna, HNH, genetiskt muterad och blir inaktiv. Därför förblir HNH-domänen i Cas9n icke-funktionell. Endast RuvC-domänen förblir aktiv, vilket gör att Cas9n kan skära eller skapa brott på enskilda DNA-strängar (Trevino och Zhang, 2014). Jämfört med Cas9 kan Cas9n effektivt minska off-target-effekter och noggrant förbättra cellreparationsmekanismer. Cas9n kan användas för att lösa olika problem, såsom att skapa brott på specifika platser i dubbelsträngat DNA. För detta ändamål kombinerades två Cas9n-molekyler och användes tillsammans (Yee, 2016). Mixed lineage kinase 3 (MLK3) är ett mitogenaktiverat proteinkinas som fungerar som en nyckelregulator under TNBC-metastasering (Cronan et al., 2012).
MLK3 kan aktivera flera signalvägar som leder till TNBC-metastaser. Till exempel reglerar c-Jun N-terminala kinasvägen (JNK) cellmotilitet och nedbrytning av extracellulär matrix, och MLK3 aktiverar JNK-vägen, vilket förbättrar cellmotiliteten och ger invasiva egenskaper (Rattanasinchai och Gallo, 2016). MLK3 reglerar även EMT. För att göra detta aktiverar den nedströms transkriptionsfaktorer såsom Snail, Slug och Twist. Dessa faktorer hämmar uttrycket av epitelmarkörer och främjar uttrycket av mesenkymala markörer, vilket leder till förvärv av en metastatisk fenotyp (Casalino et al., 2023). MLK3 har observerats spela en roll i ECM-ombyggnad och aktivering av proteaser såsom matrixmetalloproteinaser (MMP) som bryter ner ECM. Detta underlättar tumörcellsinvasion och spridning till avlägsna platser (Katari et al., 2019). Tidigare studier har således visat att MLK3 spelar en avgörande roll i TNBC. Rattanasinchai och Gallo använde TNBC-modeller för att studera MLK3:s roll och fann att det främjar cancerutveckling genom specifika signalvägar. De använde CRISPR/Cas9n för att redigera MLK3 och observerade en signifikant minskning av TNBC-metastaser (Rattanasinchai och Gallo, 2016).
dCas9, ofta kallat inaktivt Cas9, är en modifierad derivatform av Cas9-proteinet. Till skillnad från aktivt Cas9 saknar dCas9 endonukleasaktivitet, vilket gör det oförmöget att inducera DNA-dubbelsträngsbrott. Därför kan dCas9 användas för att exakt rikta in sig på specifika regioner i genomet utan några förändringar eller modifieringar av DNA-sekvensen (Wang et al., 2016). I dCas9 inaktiveras två endonukleasproteiner, RuvC och HNH, genom att undertrycka viktiga aminosyrarester. (Richter et al., 2016). Trots sin brist på DNA-klyvningsaktivitet spelar dCas9 ett antal viktiga roller inom genetisk forskning och bioteknik. Till exempel möjliggör det visualisering av specifika regioner i genomet, underlättar transkriptionsreglering och främjar epigenetiska modifieringar (Brocken et al., 2018).
Transkriptionsfaktorn ZEB1 (zinc finger E-box binding homeobox 1) spelar en specifik och kritisk roll i att mediera epitelial-mesenkymal övergång (EMT), en cellulär process som sker under embryonal utveckling, vävnadsreparation och cancerprogression. Den involverar transformationen av epitelceller till mesenkymala celler, vilket resulterar i förändringar i cellmorfologi, motilitet, invasivitet etc. (Wu et al., 2020). ZEB1 hämmar flera epitelmarkörer, såsom E-cadherin och Occludin, vilka ansvarar för att upprätthålla cell-cell-adhesion och polaritet hos epitelceller i TNBC (Moreno-Bueno et al., 2008). Dessutom aktiverar ZEB1 vissa markörer såsom N-cadherin, vimentin och fibronektin (Konradi et al., 2014) och reglerar även gener involverade i cytoskelettremodellering såsom Rho GTPaser och matrixmetalloproteinaser (MMP) (Huang). et al., 2014). 2022), dessutom påverkar det även olika signalvägar såsom transformerande tillväxtfaktor-β (TGF-β), Wnt-signalering, etc., vilket främjar tumörinvasion och metastasering i TNBC (Chen et al., 2016). Många studier och vetenskapliga bevis tyder på att ZEB1 har stor potential som ett värdefullt medel för detektion och terapeutisk intervention av TNBC. I en nyligen genomförd studie använde Waryah et al. en TNBC-modell och uppnådde fullständig suppression av ZEB1 med dCas9. De observerade således mycket hög specificitet och nästan fullständig hämning av ZEB1 under in vivo-förhållanden (Waryah et al., 2023).
CRISPR/Cas12 är ett genredigeringsverktyg som kallas CRISPR/Cpf1. Det härstammar från CRISPR/Cas-systemet, där termen Cas12 hänvisar till CRISPR-associerat protein 12 (Bharathkumar et al., 2022), vilket är helt likt Cas9. Den enda skillnaden är att det innehåller Cas12-proteinet. Jämfört med Cas9 har Cas12 några unika funktioner, såsom att generera klibbiga ändar under genredigeringsprocessen, medan Cas9 genererar trubbiga ändar (Wang et al., 2021). Denna egenskap hos Cas12 bidrar till dess specifika DNA-manipulationsteknik. Som ett protein som kan känna igen och klippa mål-DNA exakt har det extraordinär mångsidighet, vilket gör det till ett effektivt verktyg för en mängd olika tillämpningar, inklusive genredigering (Pickar-Oliver och Gersbach, 2019).
I likhet med andra CRISPR-varianter kan CRISPR/Cas12 också slå ut eller aktivera gener i TNBC, och rikta in sig på gener som spelar en viktig roll i dess patogenes eller svar på behandling (Yang och Zhang, 2023). För att åstadkomma denna process utvecklades ett styr-RNA (gRNA) som styr Cas12 till målgenen. När Cas12 binder till sitt mål introducerar det dubbelsträngsbrott i DNA och aktiverar DNA-reparationsmekanismer. Under reparationsprocessen kan felaktiga nukleotider införlivas, vilket leder till genmutationer och funktionsförlust (Zhang et al., 2021a). Dessutom användes en förbättrad version av Cas12-enzymet (kallat dCas12) för att aktivera gener. Genom att kombinera det med en transkriptionsaktivator är det möjligt att inducera vissa gener och därigenom aktivera dem. Denna teknik har stor potential att främja aktiveringen av tumörsuppressorgener (Sultan et al., 2022).
Prime editing är en nyutvecklad och extremt överlägsen genomredigeringsteknik. Den kan modifiera en organisms DNA mycket exakt (Chen och Liu, 2023). Prime editing uppnås genom integration av två huvudkomponenter: ett modifierat CRISPR/Cas9-enzym och omvänt transkriptas. CRISPR/Cas9-enzymets roll är att selektivt rikta in sig på exakta platser i genomet, medan omvänt transkriptas hjälper till att grundligt modifiera DNA:t på målplatsen (Hassan et al., 2021). I primerredigeringsmekanismen involverar det första steget skapandet av ett primerredigeringsguide-RNA (pegRNA) (Standage-Beier et al., 2021). Det innehåller målsekvensen och RNA-mallen som motsvarar det önskade redigeringsstället i mål-DNA:t. PegRNA:t introduceras sedan i målcellerna tillsammans med ett primerredigeringsnukleas (PE2). PE2 är ett fusionsprotein som består av ett Cas9-enzym, ett omvänt transkriptas och en primerredigeringsadapter (Martín-Alonso et al., 2021). Inuti cellen söker pegRNA- och PE2-komplex efter det specifika DNA de vill modifiera. Cas9-enzymet klipper DNA och skapar en mall bestående av enskilda strängar (Choi et al., 2022). Omvänt transkriptas använder denna mall för att förbereda DNA:t för redigering. Förutom att kopiera DNA ingår även instruktioner för redigering av RNA-mallen. Slutligen används den nyskapade DNA-strängen som en mall för att reparera brottet i DNA:t, vilket resulterar i en förändrad DNA-sekvens som innehåller den önskade modifieringen (Ochoa-Sanchez et al., 2021). Primerredigeringsmekanismer kan leda till utbredda mutationer i gener. Den kan rikta in sig på punktmutationer, insertioner, deletioner och till och med genutbyten (Anzalone et al., 2019; Chen och Liu, 2023). Primerredigering erbjuder flera fördelar jämfört med tidigare genomredigeringstekniker. Dessa inkluderar ökad noggrannhet, minskade effekter utanför målet och möjligheten att redigera DNA utan att förlita sig på DNA-dubbelsträngsbrott (Anzalone et al., 2020).
CRISPR/Cas9-tekniken utvecklades ursprungligen för att skydda bakterier från plasmidöverföring och faginfektion och omvandlades senare till ett effektivt RNA-baserat DNA-inriktningsverktyg för genomredigering (Jiang och Doudna, 2017). Dessutom har CRISPR/Cas9-systemet rapporterats finnas i 50 % respektive 87 % av bakteriella och arkeala genom (Ishino et al., 2018). CRISPR/Cas9 är ett potentiellt verktyg för deletion, insertion och korrigering av alla onormala genetiska sekvenser med hjälp av in vivo- och in vitro-metoder (Sabit et al., 2021). Dessutom har CRISPR/Cas9 visat sig vara en del av det adaptiva immunsystemet på grund av dess specificitet för intressanta målgener (Chen och Zhang, 2018).
CRISPR/Cas9 består av Cas9 och ett enda styr-RNA (sgRNA). Cas9 är ett endonukleas som består av flera proteinkomponenter. Dessutom har Cas9 unika strukturella och konformationsmässiga egenskaper (Pacesa et al., 2022) eftersom det består av två lober: igenkänningslober (REC) och nukleaslober (NUC). REC-loben är vidare indelad i tre regioner: REC1, REC2 och brygghelixar (Cromwell et al., 2018). NUC består av tre lober, nämligen RuvC (RuvC I, RuvC II, RuvC III), HNH och protospacer adjacent motif (PAM) interaktionsdomänen (Fig. 1) (Song et al., 2016). sgRNA består av två komponenter, inklusive CRISPR RNA (crRNA) och transkodande litet RNA (tracer-RNA) (Figur 1). SgRNA kopplar Cas9-proteinet till connexiner för att bilda ett aktivt komplex, även känt som effektorkomplexet (Richter et al., 2012). crRNA är ett baspar långt på 18–20 nukleotider som spelar en avgörande roll för att känna igen mål-DNA-sekvenser. Dessutom parar crRNA sig med mål-DNA, och tracrRNA fungerar som en byggnadsställning för Cas9-nukleaset för att binda till mål-DNA (Manghwar et al., 2019). Å andra sidan har PAM-sekvensen 3 nukleotider, vilket bekräftar, specificerar och medierar bindningen av effektorkomplexet till DNA. Cas9-proteinkomplexets subenheter RuvC och HNH har katalytisk aktivitet (Richter et al., 2012; Asmamaw och Zawdie, 2021). HNH-nukleasdomänen i Cas9-subenheten klyver DNA-strängen associerad med crRNA. RuvC-nukleasdomänen klyver andra DNA-strängar och genererar dubbelsträngsbrott (DSB), varefter två olika DNA-brottsreparationsmekanismer aktiveras (Jiang och Doudna, 2017) (Figur 1).
Figur 1. Översikt över CRISPR/Cas9 (A). Komponenter i CRISPR/Cas9-systemet: (i). Cas9-endonukleaset ansvarar för att klippa mål-DNA-sekvensen, (ii) ett enda styr-RNA (sg) som är ett resultat av fusionen av crRNA och tra-crRNA-chimärer. (två). Cas9 inkluderar flera komponenter såsom Rec I, Rec II, NUC-loben (HNH och Ruv C är delkomponenter) och PAM-interaktionsdomänen (C) med motsvarande funktioner. CRISPR/Cas9-proteinkomplexet klyver DNA-sekvenser i icke-komplementära och komplementära former (D). CRISPR/Cas9 redigerar genomet i tre steg: igenkänning, klippning och reparation. Det designade sg-RNA:t styr Cas9 och känner igen den önskade sekvensen genom den komplementära komponenten crRNA. Cas9 känner igen PAM-sekvensen vid 5′-NGG-3′ och smälter DNA:t, vilket bildar en DNA-RNA-hybrid och aktiverar klyvning. HNH-domänen i Cas9 klyver den komplementära strängen, och RuvC-domänen klyver den icke-komplementära strängen. CRISPR/Cas9 reparerar dubbelsträngat DNA genom att bryta det på två sätt: icke-homolog end joining (NHEJ) och homologistyrd reparation (HDR). NHEJ reparerar dubbelsträngat DNA i frånvaro av främmande homologt DNA genom en enzymatisk process, en felbenägen mekanism som kan infoga eller ta bort slumpmässiga DNA-sekvenser. HDR är mycket specifikt och kräver homologa DNA-mallar.
CRISPR/Cas9-medierade reparationsvägar inkluderar icke-homolog end joining (NHEJ) och homologistyrd reparation (HDR) mekanismer. NHEJ är en felbenägen väg eftersom den involverar insättning eller deletion och inte kräver något mönster under reparationsmekanismen. Den använder slumpmässiga nukleotider för att generera standardproteiner (Abbasi et al., 2021). Detta reparationssystem består av fyra komplex såsom KU-komplexet, det korskomplementerande proteinkomplexet typ 4 (XRCC-4), DNA-ändbearbetningsenzymet och proteinkinaset DNA-PKcs (Abbasi et al., 2021). KU-komplexproteinet har två subenheter, Ku 70 och Ku 80, och spelar en viktig roll i NHEJ-mekanismen, eftersom reparationsmekanismen initieras genom bindning av två subenheter (Ku 70 och Ku 80) till de trubbiga eller nästan trubbiga ändarna av mål-DNA:t (Abbasi et al., 2021), vilket fungerar som en byggnadsställning för att rekrytera andra NHEJ-relaterade faktorer till skadestället (Yang et al., 2020). XRCC-4 och DNA-ligas består av 334 respektive 911 aminosyror, och XRCC4-DNA-ligas IV-komplexet stimulerar ligering av DNA-ändar (Chatterjee et al., 2015). DNA-ändbearbetningsenzym, även känt som polynukleotidkinas 3'-fosfat, är ett DNA-ändbearbetningsenzym. Det kan ta bort 3'P-gruppen i DNA och fosforylera 5'OH-gruppen under DSB-reparation. Det involverar även reparation av enkelsträngade brott (SSB) med hjälp av SSB-reparationsvägen (Chatterjee et al., 2015). Proteinkinas DNA-PKcs är ett DNA-beroende proteinkinas som består av en katalytisk subenhet av PIKK-familjen (fosfatidylinositol 3-kinas-relaterade kinaser) och ataxia telangiectasia mutated (ATM), samt ATM- och Rad3-relaterade ATR, strängbrott (DSB) och enkelsträngade brott (Yue et al., 2020; Peng et al., 2016).
HDR är en mer exakt och lämplig reparationsmekanism eftersom informationen kopieras med hjälp av den intakta formen av den homologa DNA-duplexen, även om det kräver närvaron av systerkromatider. Detta sker under S/G2-fasen av däggdjurscellcykeln. HDR förekommer huvudsakligen i jästarter, men NHEJ är avgörande hos däggdjur (Burma et al., 2006; Abbasi et al., 2021). Den fullständiga reparationsmekanismen visas i figur 1.
Eftersom TNBC orsakas av genetiska och epigenetiska avvikelser kan korrigering av maligna genomiska/epigenomiska avvikelser med hjälp av CRISPR/Cas9 vara en rimlig terapeutisk metod (Chen et al., 2019). Dessutom kan vissa transkriptionsfaktorer som är involverade i cellspecifik transkriptionsreglering uppvisa unika egenskaper hos cancerceller, vilket tyder på att transkriptionsreglering kan vara en utmärkt metod för cancerbehandling (Drost et al., 2017). Att utnyttja dessa molekylära egenskaper hos tumörer, såsom genetiska, epigenetiska och transkriptionella defekter, för läkemedelsutveckling kan förbättra kliniska resultat och minska screeningskostnaderna. CRISPR är ett potentiellt genredigeringsverktyg som inte bara kan upptäcka och identifiera cancerframkallande genomiska mål, utan också kan användas för att redigera, undertrycka och epigenetiskt modifiera onkogener i mänskliga celler (tabell 1) (Ahmed et al., 2021). Flera CRISPR-screeningar har utförts för att leta efter gener associerade med tumörsuppressorer, onkogener och läkemedelsresistens. Användningen av CRISPR/Cas9 för att redigera olika TNBC-onkogener visas i figur 2.
Figur 2. Genredigering av olika TNBC-onkogener med hjälp av CRISPR/Cas9 vilket resulterar i minskad tumörtillväxt och metastasering. Dessa onkogener inkluderar CDK7, NAT1, UBR5, YTHDF2, ITGA9, CXCR4 och CXCR7, Crypto1, ROR1 och ST8SIA, vilka är involverade i uppkomsten och metastaseringen av TNBC.
Cancercellsmigration, invasion och epitelial-mesenkymal övergång (EMT) är associerade med ITGA9. Tidigare studier har visat att ITGA9 är en nyckelaktör i Notch-vägen och spelar en intressant roll i rabdomyosarkommetastaser (Molist et al., 2020). Dessutom fann man att ITGA9 var nära associerat med patientprognos i flera tumörtyper, inklusive bröstcancer (Wang Z. et al., 2019). Dessutom visade bioinformatisk analys av ITGA9 att dess uttryck i TNBC var signifikant högre än i andra bröstcancersubtyper. Förhöjda ITGA9-nivåer är associerade med tumörmetastaser och återfall hos TNBC-patienter. Knockout av ITGA9 med CRISPR/Cas9 resulterade i cancerstamcellsliknande egenskaper (CSC), tumörangiogenes, tumörtillväxt och minskad metastasering genom att främja β-katenin-nedbrytning i TNBC (Wang Z. et al., 2019).
Crypto-1 är en medlem av TGF-β-familjen och är avgörande för tidig embryogenes, stamcellsupprätthållande och cancermetastasering (Ishii et al., 2021). Även känt som Tdgf-1, är det ett onkogent GPI-förankrat signalprotein involverat i regleringen av bildandet av primitivstrimman, mesoderm och endoderm, samt etableringen av vänster/höger-asymmetri i utvecklingen av kroppsorgan under embryogenesen (Zhang et al., 2021b). Dessutom har Cripto-1 visat sig vara involverat i epitelial-mesenkymal övergång (EMT) som en stamcellsmarkör (Zhang et al., 2021b). EMT är avgörande inte bara för olika processer såsom embryonal utveckling, fibros och sårläkning, utan också för cancerinvasion och metastasering. Dessutom har Cripto-1 visat sig interagera med fyra Notch-receptorer och förbättra deras posttranslationella mognad (Brandstadter och Maillard, 2019). Notch-signalvägen är känd för att vara involverad i underhållet av mänskliga bröstcancerceller. Studier har visat att CRISPR/Cas9-medierad knockout av Crypto-1 hämmar cancertillväxt och metastasering. Därför kan Crypto-1 bli ett viktigt terapeutiskt mål för TNBC (Castro et al., 2015).
XCL12-proteinet och dess kemokinreceptor CXC (CXCR4 och CXCR7) spelar olika roller i cancercellsproliferation, tillväxt, migration och invasion (Wu et al., 2015). Dessa kemoreceptorer har associerats med utvecklingen av TNBC genom flera signalvägar i både in vivo- och in vitro-modeller (Wu et al., 2015). Dessutom är aktivering av CXCR4 och CXCR7 associerad med större mottaglighet för metastaser och dålig prognos vid TNBC (Karn et al., 2022). Därför kan knockout av CXCR4 och CXCR7 bli effektiva läkemedelsmålgener för behandling av bröstcancer, inklusive TNBC. Studie av Yang et al. Yang et al (2019) använde CRISPR/Cas9 för att samtidigt slå ut CXCR4- och CXCR7-generna och fann att TNBC-proliferation, tillväxt, migration och invasion hämmades signifikant (Yang et al., 2019).
Ökade nivåer av miR-3662, en TNBC-onkogen, observerades i bröstcancervävnader (Yi et al., 2022). Nedreglering av miR-3662 har visat sig hämma bröstcancertumörtillväxt och metastasering både in vivo och in vitro (Agarwal och Gupta, 2021). HBP-1 är en potent hämmare av Wnt/-catenin-signalering och är sannolikt ansvarig för miR-3662-medierad tillväxt av TNBC-celler. Nyligen fann Yi et al. att miR-3662-HBP1-axeln reglerar Wnt/-catenin-signalvägen i TNBC-celler (Yi et al., 2022). På grund av dess tumörspecifika uttryck kan miR-3662 vara ett potentiellt terapeutiskt mål för TNBC. Således kan CRISPR/Cas9-medierad nedreglering av miR-3662 vara en utmärkt metod för att utveckla nya läkemedel för behandling av TNBC.
UBR5 är ett 300 kDa nukleofosfoprotein som har identifierats som en nyckelregulator för tumörbildning, metastasering och immunsvar i olika cancerformer (Shearer et al., 2015; Fu et al., 2023). UBR5 har rapporterats vara starkt uppreglerat i TNBC-prover och stimulerar ERα-funktionen genom att inducera proliferation genom sin ubiquitinligasaktivitet (Bolt et al., 2015). Studier av hel exomsekvensering av primära TNBC-prover visade också ökat uttryck av UBR5, vilket tyder på dess roll i utvecklingen av TNBC. Dessutom visade CRISPR/Cas9-driven deletion av UBR5 signifikant hämning av TNBC-metastasering och tillväxt i experimentella musmodeller. Dessutom återställde inkludering av UBR5 i en vildtypsmusmodell dess fulla funktionalitet, medan denna effekt inte observerades i inaktiverade mutantstammar (Liao et al., 2017). Brist på UBR5 är associerad med ökad apoptos, nekros och hämning av tumörtillväxt i TNBC på grund av dålig angiogenes. På grund av förlusten av UBR5 minskar tumörspridningen till avlägsna organ, och UBR5 inducerar onormal EMT främst genom att minska E-cadherinuttryck (Zhang och Weinberg, 2018). Nyligen visades UBR5 vara en mycket viktig faktor i IFN-γ-inducerad PDL1-transkription i TNBC på grund av dess brist på E3 ubiquitineringsaktivitet. RNA-transkriptomanalys visade att UBR5 kan ha systemiska effekter på gener associerade med IFN-γ-vägen och främja PDL1-transaktivering genom att öka aktiveringsnivåerna av proteinkinas-RNA (PKR) och dess signaltransduktorer och aktivatorer, transkription 1 (STAT1) och interferonreglerande faktor 1 (IRF1). Emellertid har CRISPR/Cas9-medierad kombinerad ablation av UBR5- och PD-L1-uttryck en synergistisk terapeutisk effekt jämfört med endera blockaden ensam, med djupgående effekter på tumörmikromiljön (Wu et al., 2022). CRISPR/Cas9 kan således vara ett viktigt verktyg för att hämma UBR5-funktionen och därigenom undertrycka TNBC-metastasering och tumörtillväxt.
ROR1 är ett typ I transmembranprotein som uttrycks under cancer och embryonal utveckling och har identifierats som ett onkofetalt protein (Nicholas Borcherding, 2014). Det invasiva beteendet hos olika mänskliga cancerformer är associerat med uppreglering av ROR1. Lovande resultat har erhållits från in vivo- och in vitro-studier som involverar terapeutiska föreningar riktade mot ROR1 (Chien et al., 2016). Förhöjda nivåer av ROR1 mRNA i bröstvävnadsbiopsier har också associerats med aggressiva basalliknande brösttumörer (BL) och deras migration till andra delar av kroppen. Dessutom har överuttryck av ROR1 identifierats som en prognostisk markör för utveckling av TNBC (Chien et al., 2016). Att tysta ROR1 med hjälp av CRISPR/Cas9 för att undertrycka TNBC-tillväxt och metastasering skulle dock vara en effektiv strategi.
Sialyleringsprocessen involverar tillsats av sialinsyra till glykokonjugater, vilket katalyseras av sialyltransferaser (ST). ST8SIA1 tillhör ST-familjen och spelar en viktig roll i patogenesen av olika sjukdomar såsom lymfatisk leukemi och kolorektal cancer (Chang et al., 2018). RNA-sekvensanalys visar att ST8SIA1 uttrycks i hög grad i bröstvävnad hos TNBC-patienter och är positivt korrelerad med mutationer i tumörsuppressorgenen p53, vilket kan bidra till patogenesen av TNBC (Battula et al., 2017). Dessutom är ST8SIA1 involverat i metastasering och återfall av TNBC, vilket tyder på att det spelar en viktig roll i uppkomsten och utvecklingen av TNBC. I en in vitro-modell av TNBC visades nedbrytning av ST8SIA1 av CRIPSR/Cas9 blockera tillväxt och metastasering (Battula et al., 2017). Detta tyder på att CRISPR/Cas9 kan vara ett viktigt verktyg för att hämma funktionen av onkogenen ST8SIA1 vid behandling av TNBC.
NAT1 är ett metaboliskt enzym som katalyserar bildandet av fas II xenobiotiska föreningar och uttrycks i nästan alla mänskliga vävnader. NAT1 kan använda kofaktorn folat för att rikta in sig på acetyl-CoA (acetyl-CoA) även i frånvaro av det aromatiska aminsubstratet (Stepp et al., 2015; Laurieri et al., 2014). Studier har visat att NAT1 reglerar matrixmetalloproteinas 9 (MMP9)-funktionen i bröstcancercellsmodeller och skyddar mot reaktiva syreradikaler (ROS) under glukosbrist (Wang et al., 2018). Deletion av NAT1 har visat sig hämma pyruvatdehydrogenaskomplexet, vilket leder till mitokondriell dysfunktion (Wang L. et al., 2019). Dessutom har olika andra rapporter visat att NAT1-hämning med hjälp av små molekyler och siRNA-tystning kan minska invasiviteten och proliferationen av bröstcancerceller (Stepp et al., 2018). Nyligen användes CRISPR/Cas9 för att undertrycka NAT1 i bröstcancercellinjen MDA-MB-231, vilket påverkar cellmetabolismen beroende på dess uttrycksnivå. Denna studie visade också att NAT-1 är avgörande för progression och metastasering av TNBC (Carlisle et al., 2020).
Koordinerad transkription av onkogener regleras av superförstärkare, transkriptionsfaktorer och kofaktorer (Hnisz et al., 2015). Dessutom krävs en grupp cyklinberoende kinaser (CDK), såsom CDK7, CDK8, CDK9, CDK12 och CDK13, för transkriptionsreglering. Bland dem är CDK7 involverat i fosforyleringen av RNA-polymeras II, vilket är mycket viktigt för initiering och expansion av onkogentranskription i patogenesen av TNBC. I en banbrytande studie hämmade deletion av CDK7 med CRISPR/Cas9 TNBC, vilket indikerar att patogenesen av TNBC är CDK7-beroende (Wang Y. et al., 2015).
Studier har visat att mutationer i MYC och RBP (RNA-bindande protein) kan leda till apoptos, medan enskilda genmutationer i MYC eller RBP inte påverkar tillväxten av cancerceller (Einstein et al., 2021). Mer än 1000 RBP i det mänskliga genomet har screenats med hjälp av ett CRISPR/Cas9-baserat bibliotek. Bland dem visade sig 57 RBP vara avgörande för tillväxten av cancerceller med högt förhöjda MYC-nivåer (Wheeler et al., 2020). Dessutom är YTHDF2 viktigt för att upprätthålla TNBC-celltillväxt och minskar mängden metylerade transkript under högnivåtranskription och translation i cancerceller med högre MYC-uttryck. Dessutom är YTHDF2 inte essentiellt för cancerceller, som är mindre beroende av förhöjda MYC-nivåer för att förlänga överlevnaden hos TNBC-patienter (Einstein et al., 2021), vilket tyder på att det kan vara ett potentiellt terapeutiskt mål för läkemedel som kan övervinna TNBC.
Zinkfingerproteiner (ZNF) utgör ungefär 1 % av det totala mänskliga genomet. Studier har visat att ZNF kan reglera cellproliferation i olika cancerformer, såsom levercancer, bröstcancer och kolorektal cancer (Zhang W. et al., 2021; Li et al., 2017). Bibliotek genererade genom CRISPR-knockout har använts för att screena olika tumörsuppressorgener (TSG) i bröstcancerceller (Shalem et al., 2014). Sedan dess har en transkriptomisk studie av CRISPR/Cas9 ZNF319-deleterade bröstcancerceller visat att ZNF319 är en tumörsuppressorgen som minskar bröstcancerproliferation och därför är involverad i olika potentiella signalmekanismer och andra biologiska funktioner (Wang L. et al., 2022).
Ferroptos är en typ av programmerad celldöd som är beroende av närvaron av järn. Det är känt att utvecklingen av ferroptos påverkas av närvaron av lipidperoxider. Dessutom har PKCβII rapporterats uppvisa tidig lipidperoxidation, och ökad lipidperoxidation är associerad med ferroptos. Screening av ett bibliotek av CRISPR/Cas9-medierade kinashämmare visade att PKCβII är involverat i processen för lipidperoxidation, vilket är avgörande för ferroptos i MDA-MB-231-celler (Zhang et al., 2022). Detta tyder därför på att knockout av PKCβII av CRISPR/Cas9 kan vara ett potentiellt mål för en tumörsuppressorgen för behandling av ferroptosrelaterade sjukdomar (Zhang et al., 2022).
Läkemedelsresistens tros vara orsaken till cirka 90 % av dödsfallen hos cancerpatienter och är en av de största utmaningarna inom cancerbehandling (Bukowski et al., 2020). Resultaten indikerar att ett tillräckligt antal gener relaterade till läkemedelsutflöde, DNA-reparation, apoptos och olika cellsignaleringsvägar är associerade med läkemedelsresistens (Haider et al., 2020). Bland dem har flera gener riktats in sig på CRISPR/Cas9-verktyg och har visat lovande resultat när det gäller att minska läkemedelsresistens och öka effektiviteten av anticancerbehandlingar (Vaghari-Tabari et al., 2022). Dessutom har högkapacitets CRISPR/Cas9-gen-knockout-screeningbibliotek visat sig vara inblandade i att modifiera funktionen hos potentiella mål för läkemedelsresistensgen (Shalem et al., 2015). För att identifiera paklitaxelresistensgener användes RNA-sekvensering i kombination med genomomfattande sgRNA-biblioteksscreening för att identifiera åtta kandidatgener, inklusive histondeacetylas 9 (HDAC9), som är associerade med läkemedelsresistens hos patienter med återkommande TNBC (B et al., 2020). I en annan studie observerades ökat uttryck av diserin/treonin och tyrosinproteinkinas (DSTYK) under överlevnaden hos TNBC-patienter som behandlades med cancerläkemedel. Dessutom ökade CRISPR/Cas9-medierad nedreglering av DSTYK signifikant apoptos av läkemedelsresistenta cancerceller in vitro (SUM102PT-celler och MDA-MB-468-celler) och en in vivo TNBC-modell (Ogbu et al., 2021).
Även om TNBC har onormal aktivering av MAPK-vägen, är den kliniska effekten av MEK-riktade terapier dålig. En CRISPR/Cas9 genombiblioteksscreening visade att hämning av PSMG2 (proteommonteringschaperon 2) sensibiliserar TNBC BT549- och MB468-celler för MEK-hämmaren AZD6244. CRISPR/Cas9-nedbrytning av PSMG2 förändrade normal proteasomfunktion, vilket ledde till autofagimedierad nedbrytning av PDPK1, vilket ytterligare förbättrade tumörceller i TNBC-musmodeller inducerade av AZD6244 (MEK-hämmare) och MG132 (proteasomhämmare). Således kan proteasom- och MAP-kinas (MEK)-hämmare administreras synergistiskt för att minska tumörcellsproliferation (Wang X. et al., 2022).
CRISPR/Cas9 har också använts för att screena för förlust av genfunktion som leder till TNBC-resistens (Shu et al., 2020). Ge et al. förklarade mekanismen för läkemedelsresistens hos cancerceller behandlade med JQ1, en BET-bromodomänhämmare (BBDI), i TNBC. Med hjälp av CRISPR/Cas9 fann de att borttagning av rb1-genen orsakade att TNBC blev resistenta mot anticancerläkemedlet JQ1. Därför är rb1-funktionen viktig i svaret på JQ1-läkemedel i TNBC. De rapporterade också att paklitaxel är en CDK4/6-kinas/mikrotubuli-hämmare, och dess kombination med BBDI:er såsom JQ1 kan ge lovande terapeutiska svar på läkemedelsresistenta TNBC (Ge et al., 2020).
Transkriptionslandskapet för långt icke-kodande RNA (lncRNA) har rapporterats vara ansvarigt för resistens mot neoadjuvant behandling vid TNBC. Denna studie visar att fem olika MALAT1 lncRNA-transkript uttrycks i hög grad i TNBC. Dessutom ökade CRISPR/Cas9-medierad deletion av MALAT1 känsligheten hos TNBC BT-549-celler för paklitaxel och doxorubicin, vilket tyder på en potentiell roll för MALAT1-resistens vid TNBC (Shaath et al., 2021).
Mutationer i BRCA1 (BRCA1m) är heterogena och därför svåra att upptäcka. Att rikta in sig på PARP1 (poly(ADP-ribos)polymeras), den syntetiska letala partnern till BRCA1, kan öka TNBC-läkemedelskänsligheten för kemoterapi. Med hjälp av CRISPR/Cas9 ökade deletion av PARP1 känsligheten hos cancerläkemedel som doxorubicin, gemcitabin och docetaxel för mBRCA1-mutanta TNBC-celler, vilket tyder på att PARP1 också är involverat i läkemedelsresistens i TNBC (Vaghari-Tabari et al., 2022). Mutationer i tumörsuppressorgenerna BRCA1 eller BRCA2 är kända för att öka sannolikheten för att utveckla bröstcancer hos människor. Behandling av dessa patienter kräver användning av PARP-hämmare. Dessutom har det visats att knockout av nukleotid-salvagefaktorn DNPH1 med hjälp av CRISPR/Cas9 kan avlägsna den toxiska nukleotiden 5-hydroximetyldeoxyuridin (hmdU) monofosfat, och därigenom förbättra responsen hos BRCA-bristfälliga celler på känslighet för PARP-hämmare (Fugger et al., 2021). CRISPR/Cas9 och PARP1-hämmare kan således bli en viktig behandlingsstrategi för TNBC.
Genen för penetrerande glykoprotein (P-gp) är en multiresistensgen som generellt är uppreglerad i cirka 41 % av alla TNBC (Sun et al., 2020). P-gp-inducerad läkemedelsutflöde har identifierats som en nyckelregulator för läkemedelsresistens vid bröstcancer. P-gp-hämmare har visat ökad känslighet för cancerläkemedel vid bröstcancer (Famta et al., 2021). Således kan CRISPR/Cas9-medierad ablation eller undertryckande av P-gp och P-gp-hämmare vara mycket viktiga metoder för att övervinna läkemedelsresistens vid TNBC.
ATP-bindande kassetttransportör G2 (ABCG2) är känd för att orsaka läkemedelsresistens vid TNBC (Palasuberniam et al., 2015), även om det för närvarande inte finns några rapporter om sambandet mellan CRISPR/Cas9 och ABCG2-tystning och inaktivering av tumörsuppressorgen. PTEN kan förstärka ABCG2-aktivering (Palasuberniam et al., 2015), (Deepak Singh et al., 2021). Därför kan användning av CRISP/Ca9 för att avlägsna ABCG2 och kombination av det med en ABCG2-hämmare vara en lämplig behandling för att övervinna läkemedelsresistens vid TNBC. Tabell 2 nämner CRISPR/Cas9 som riktar sig mot alla resistensgener.
Tabell 2. CRISPR/Cas9 riktar sig mot olika TNBC-resistensgener för att sensibilisera celler för cancerläkemedel.
CRISPR/Cas9-bibliotek är potentiella verktyg för screening av genmutationer associerade med cancerpatogenes (Chan et al., 2022). Denna screeningmetod involverar fyra steg såsom (a) bibliotekskonstruktion, (b) lentiviral transduktion, (c) fenotypisk screening och (d) målgenanalys. Även om TNBC har onormal aktivering av MAPK-vägen, är den kliniska prognosen för MEK-riktad behandling för TNBC-patienter som bär mutationer i tumörsuppressorgener såsom PTEN, RB1 och TP53 mycket dålig.
Dessutom testade en gen-knockout-screening med CRISPR/Cas9 den mest potenta och selektiva molekylen, dehydrokatrol, som finns rikligt förekommande i guatemalanska blom- och bladextrakt, för att förstå effekten av dehydrokatrol på MDA-MB-231. Mekanismer för selektiv cellcytotoxicitet. Mesenkymala stamegenskaper hos TNBC-subtyper. Denna CRISPR/Cas9-baserade screening visade också att HSD17B11, en gen som kodar för 17β-hydroxysteroiddehydrogenas typ 11, uttrycks i hög grad i MDA-MB-231-celler och resulterar i dehydrofalkarinol specifik för MDA-MB-231-celler (Grant et. al., 2020). Detta tyder således på att CRISPR/Cas9 genomscreening har stor potential för att identifiera mekanismerna bakom de anticanceregenskaper som potentiella naturliga föreningar har.
Dessutom studerades sårbarheten hos TNBC för cancer med hjälp av en opartisk genomomfattande in vivo CRISPR/Cas9-screening, som visade ett samband mellan onkogena och tumörsuppressorvägar. Viktiga komponenter i mTOR- och Hippo-vägarna har rapporterats spela viktiga roller i tumörreglering vid TNBC. Dessutom har studier visat att farmakologisk hämning av mTORC1/2 och YAP-onkoprotein effektivt hämmar patogeniciteten hos TNBC med hjälp av en in vitro-läkemedelsmatrixsynergimodell och in vivo patient-deriverade xenograft. Dessutom förstärker Torin-1-medierad mTORC1/2-hämning makropinocytos, medan verteporfin-inducerad YAP-hämning leder till TNBC-celldöd. Sammantaget belyser dessa resultat kraften och robustheten hos genomomfattande in vivo CRISPR-screening för att identifiera nya och effektiva behandlingar för TNBC (Dai et al., 2021).
Dysreglering av immunsystemet är en viktig faktor i tumörbildning. Cancerceller undviker immunförsvarets clearance genom att kringgå försvarsmekanismer, inklusive att störa immuncellernas aktivitet i tumörmikromiljön och äventyra immunsystemet. Därför kan utvecklingen av ett förbättrat immunförsvar vara en viktig metod för att bekämpa tumörer. Användningen av CRISPR/Cas9-baserad genmodifiering tar itu med flera problem relaterade till immundysfunktion ur olika perspektiv. CRISPR/Cas9 har använts för att förbättra antitumörimmunitet mot bröstcancer genom följande vägar (Figur 3).
Figur 3. CRISPR/Cas9-immunterapi riktar sig mot TNBC-celler. Förlust av CDK5 och nedreglering av PDL1 och CD155 stärker immunförsvaret. Likaså ökade förlust av A2AR och nedreglering av TAA:er såsom HER2, mucin 1 och TEM8 effektiviteten hos CAR-T-celler i att döda cancerceller. CRISPR/Cas9-driven T-cellscreening har visat att störning av p38-kinas förstärker T-cellers antitumöraktivitet. T-celler modifierade av CRISPR/Cas9 ökar uttrycket av TCR (T-cellsreceptor), vilket resulterar i att T-celler har antitumöraktivitet.
Målet med immunterapi är att stimulera immunförsvaret att attackera cancerceller. Överuttryck av immunkontrollproteiner förhindrar vanligtvis autoimmuna reaktioner men kan hjälpa cancer att undvika dem (Topalian et al., 2015). Dessa proteiner förhindrar immunreaktioner genom att binda till receptorer på ytan av immunceller. Flera kontrollproteiner (såsom CD155 och PD-L1) riktar sig mot PD-1-receptorn på immunceller och uttrycks i bröstcancer, särskilt TNBC (Li Y.-C. et al., 2020). Nedreglering av PD-L1 eller dess receptor med hjälp av CRISPR/Cas9 kan stimulera immunförsvaret att attackera TNBC-tumörer (Yahata et al., 2019). Dessutom har nedreglering av PD-L1-uttryck genom CRISPR/Cas9-medierad deletion av CDK5 visat sig hämma tumörtillväxt in vitro och in vivo (Deng et al., 2020). Tillväxthämning i in vitro- och in vivo-modeller av bröstcancer tyder på att shRNA-medierad reduktion av CD155 kan ha en terapeutisk effekt på bröstcancer (Gao et al., 2018).
CAR T-celler uttrycker CAR som känner igen tumörassocierade antigener (TAA) och kan använda knockdown av checkpointproteiner för att förbättra sin aktivitet (Li C. et al., 2020). Det finns olika potentiella mål för CAR T-cellsterapi vid bröstcancer, inklusive flera TAA såsom HER2, mucin1 och TEM8 (Bajgain et al., 2018). Det finns bevis för att CAR T-celler som riktar sig mot mesotelin (överuttryckt i TNBC BT-459-celler) är mer effektiva mot cancer när PD-1 slås ut med CRISPR/Cas9 (Hu et al., 2019). Att isolera T-celler från patienter och sedan redigera dem ex vivo är dock en arbetsintensiv och tidskrävande process. Även om universella T-celler kan minska isoleringskraven, bör donator-T-celler som uttrycker humant leukocytantigen (HLA) klass I och T-cellsreceptor (TCR) avlägsnas för att förhindra graft-versus-host-avvikelser (Ren et al., 2017, 2017a). Med hjälp av CRISPR/Cas9 kan HDR samtidigt eliminera TCR och HLA och slå ut genen som kodar för CAR. Studier har visat att CRISPR/Cas9 kan användas för att introducera anti-CD19 CAR i TCR-locuset, och därigenom effektivt producera CAR utan att utarma T-celler (Dimitri et al., 2022). Multiplextekniker har utvecklats för att generera allogena CAR T-celler genom att samtidigt eliminera TCR, beta-2-mikroglobulin (B2M), HLA-I-subenhet och andra proteiner såsom PD-1 och CTLA-4, vilka kan ha bättre anticanceregenskaper mot TNBC (Eyquem et al., 2017; Liu et al., 2017; Ren et al., 2017b; Dimitri et al., 2022).
Användning av CRISPR/Cas9 skulle kunna förbättra effektiviteten hos CAR-T-celler. Adenosin är känt för att ha immunsuppressiva egenskaper och kan minska immunitet mot cancer genom att blockera T-cellsfunktionen och aktivera adenosin A2A-receptorer (A2AR) (Vigano et al., 2019). Tystning av A2AR med CRISPR/Cas9 förbättrade signifikant effektiviteten hos CAR-T-celler in vivo (Giuffrida et al., 2021). T-celler är kända för att uppvisa olika fenotypiska egenskaper såsom cellulär expansion, differentiering, oxidativ stress och genomisk stress. CRISPR/Cas9-baserad T-cellscreening avslöjade störningar av 25 olika T-cellsreceptorkinaser. Bland dem har deletion av p38-kinas visat sig förbättra antitumöraktiviteten hos T-celler, vilket indikerar att p38-kinas är en nyckelregulator för CAR-T-cellsreglering (Gurusamy et al., 2020).
T-celler kan genetiskt modifieras med hjälp av CRISPR/Cas9 för att producera höguttryckta TCR. Överföring av genetiskt modifierade T-celler till patienter har visat starkare anticanceraktivitet än endogena T-celler. Därför kan endogena TCR konkurrera med genetiskt förändrade TCR hos patienter, vilket kan påverka potentialen för cancerimmunterapi. För att övervinna detta problem kan användning av CRISPR/Cas9 för att avlägsna endogen TCR-β i mottagarceller och därefter överföra TCR-β T-celler till cancerpatienter uppvisa bättre immunsvar mot cancer utan behov av sexuell konkurrens mellan endogena TCR (Fan et al. 2018). Således, med undantag för CRISPR-modifierade T-celler, är TCR tusen gånger känsligare för tumörantigener än normala TCR-transducerade T-celler. Dessutom uppvisar förändrade T-celler genererade av γδ TCR+ CRISPR i olika leukemier högre uttryck av CD4+ och CD8+ T-celler än standard TCR-överföring (Legut et al., 2018). Således kan modifierade T-celler genererade med CRISPR/Cas9 vara en effektiv immunterapimetod för att övervinna TNBC.
Integriner är celladhesionsmolekyler som finns i cellulära transmembran och främjar cellernas bindning till den extracellulära matrisen (ECM) (Hamidi och Ivaska, 2018). Dysreglering av integriner är associerad med cancerutveckling och migration genom att förändra den extracellulära matrisen, vilket leder till cancercellsöverlevnad i cirkulationen (Hamidi och Ivaska, 2018). CRISPR/Cas9-medierad integrin-knockdown saktar ner tumörprogression, metastasering och kolonisering i TNBC. Nedbrytning av integrin a5 (ITGA5) har rapporterats minska cellmigration och progression i andra cancerformer såsom lungcancer (Ju et al., 2017), vilket tyder på att integrin a5 också kan vara en nyckelfaktor i patogenesen av TNBC.
Att generera knockout-möss med traditionella embryonala stamceller (ES) är en arbetsintensiv, tidskrävande och ineffektiv process. Det tar månader och år att rikta in sig på ES-celler genom homolog rekombination, avla chimära möss och sedan korsa dem med heterozygota möss för att producera homozygot avkomma. Komplex korsavel krävs för att skapa möss med flera genetiska mutationer. Många problem har dock uppstått när man använder möss som genererats genom ablation av ES-celler med CRISPR/Cas9 eller genom mikroinjektion av CRISPR/Cas9-komponenter i encelliga befruktade ägg. Till exempel sker introduktion av förändringar ofta vid bialleliska loci och är inte genspecifik. Det rapporterades nyligen att ES-celler som använder CRISPR/Cas9-teknik samtidigt kan infoga bialleliska mutationer i upp till 5 gener (Nishizono et al., 2021). För detta ändamål transfekterades Cas9 mRNA och fem genspecifika gRNA samtidigt in i ES-celler. Detta belyser hur lovande och effektiv denna procedur är, även om dessa mutationer kan ha förts vidare när grundlinjer avlades för att producera femfaldiga knockout-möss. Studien rapporterar också en överraskande upptäckt: ES-celler behövs inte längre för att skapa genetiskt modifierade möss. Istället, för att ta bort specifika genprodukter, injicerades Cas9 mRNA och gRNA i embryon i encelliga stadier. Som ett resultat har knockout-grundlinjer skapats som teoretiskt sett kan användas för att studera konsekvenserna av gendeletion hos möss (Qin et al., 2016). CRISPR/Cas9 möjliggör således skapandet av transgena möss för att behandla TNBC till en lägre kostnad än traditionell genteknik. Med hjälp av CRISPR/Cas-systemet har en ny knockout-musmodell utvecklats som framgångsrikt kan introducera punktmutationer i en eller flera endogena gener i TNBC. Baserat på detta koncept kan djurmodeller av TNBC också utvecklas med hjälp av CRISPR/Cas9-medierad deletion av BRCA1 och p53, vilket resulterar i förlust av HR-reparation, genomisk instabilitet och mutanta fenotyper (Annunziato et al., 2020).
För närvarande används olika metoder som mammografi, magnetisk resonanstomografi (MRT) och ultraljud för att diagnostisera TNBC. Dessa metoder har dock vissa begränsningar. Mammografi används för att diagnostisera lokal bröstvävnad snarare än metastaser, där cancerceller har migrerat till andra organ. Ultraljud är inte en tillförlitlig metod för att diagnostisera TNBC (Chen och Lee-Felker, 2023). MR har högre känslighet än ultraljud och mammografi, men dess diagnostiska noggrannhet är begränsad (Sha och Chen, 2022). Vävnadsbiopsi är ett invasivt sätt att identifiera cancerceller. I vissa fall kan dock en biopsi missa cancervävnad om nålen avviker från det aktuella området. Dessutom är det mycket dyrt och kan vara traumatiskt för patienten. TNBC är en heterogen typ av cancer, så en biopsi kanske inte ger tillräckligt med information om cancertypen. Därför behövs det snarast en ny diagnostiskt tillförlitlig metod för att upptäcka TNBC. CRISPR/Cas9 kan fungera som ett mycket känsligt och minimalt invasivt alternativ för bröstcancerdiagnos. För detta ändamål kan CRISPR/Cas9-baserade strategier användas för att förbättra PCR-metoder för diagnos av TNBC. Först används Cas9- och cpf1-proteinerna i CRISPR-systemet för att avlägsna ospecifikt DNA, och sedan kan dessa två proteiner (Cas9 och cpf1) känna igen PAM-sekvensen innan de binder till mål-DNA:t (Deepak Singh et al., 2021). Således kan PCR identifiera mutationer associerade med cancerutveckling. Flera studier har använt denna CRISPR-baserade strategi för att detektera olika mutationer i olika cancerformer (Safari et al., 2019). Således kan CRISPR-baserade PCR-metoder minska beroendet av TNBC-diagnos av invasiva metoder såsom biopsibaserad immunhistokemi.
Genotypiska förändringar i hormonreceptorreglering har också påvisats vid TNBC (Chen och Russo, 2009). CRISPR/Cas9-baserade PCR-strategier med mikroarrayer för vårdnära diagnostik kan effektivt övervaka dessa mutationer (Hajian et al., 2019). Det skulle också kunna förse vårdgivare med relevant information om specifika mutationer hos TNBC-patienter, vilket skulle kunna bidra till att förbättra deras behandlingsförlopp. Denna kombinerade teknik har dock begränsningar. Därför krävs omfattande forskningsinsatser innan denna CRISPR/Cas-PCR-metod kan användas inom sjukvården för diagnos av TNBC (Yang et al., 2019).